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Lavaggio bronco-alveolare (BAL) nel cane e nel gatto

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La neutropenia nel cane e nel gatto

Con neutropenia si intende una riduzione al di sotto dell’intervallo di riferimento del valore assoluto dei granulociti neutrofili circolanti (solitamente al di sotto di 2.900 cellule/uL nel cane e di 2.500 cellule/uL nel gatto (Weiss et al., 2010)) ed è una condizione meno frequente rispetto alla neutrofilia, soprattutto nel cane.

Riduzioni artefattuali del numero dei neutrofili possono verificarsi in seguito a ritarda processazione del campione poiché è possibile si formino aggregati di neutrofili in vitro per effetto dell’EDTA, oppure a causa della presenza di un coagulo in provetta (Zandecki et al., 2007).

CAUSE DI NEUTROPENIA (da Stockham e Scott, 2008, modificato):

Infiammazione

È una condizione che si verifica in seguito a gravi infiammazioni acute. Da un punto di vista fisiopatologico, la neutropenia avviene in poche ore dall’inizio dello stimolo flogistico: i granulociti neutrofili del pool circolante (nel sangue) e del pool marginale (adeso alle pareti dei vasi) vengono richiamati da citochine o altre sostanze chemiotattiche nei tessuti convolti dalla flogosi. A causa dell’acutezza dell’insorgenza dell’infiammazione, una volta esauriti i neutrofili del pool marginale e circolante, si attinge al pool maturativo del midollo osseo; per questa ragione spesso è presente un left shit (rigenerativo o degenerativo in base al numero di neutrofili immaturi provenienti dal pool maturativo): il midollo risponderà alla richiesta aumentando la produzione dei granulociti neutrofili in un paio di giorni, periodo trascorso il quale potranno ricomparire in circolo forme più mature (neutrofili segmentati). Inoltre, alla valutazione dello striscio ematico è frequente osservare moderati - gravi segni di tossicità citoplasmatica.

Le patologie che più comunemente portano a questo tipo di neutropenia sono batteriche e virali (ad esempio la parvovirosi con meccanismi multifattoriali).

Endotossemia

Le endotossine prodotte da batteri Gram negativi hanno la capacità di spostare i granulociti neutrofili dal pool circolante al pool marginale, stimolando l’organismo a produrre mediatori infiammatori (citochine come IL- 1 e TNF) che fan si che i neutrofili aderiscano alle cellule endoteliali; inoltre hanno la capacità di far rilasciare dal midollo osseo i granulociti neutrofili ancora immaturi entro poche ore dallo stimolo, pertanto in caso di endotossemia, la neutropenia è tendenzialmente di breve durata.

Aumentata distruzione periferica

La neutropenia viene causata da una distruzione indiretta (immunomediata) o diretta dei granulociti neutrofili.

La neutropenia immunomediata è una patologia molto rara nel cane e ancora di più nel gatto (Waugh et al., 2014); alla sua diagnosi presuntiva si giunge seguendo i seguenti criteri:

• Severa neutropenia (in genere inferiore a 1.500 cellule/uL (Devine et al, 2017) oppure inferiore a 500 cellule/uL (Weiss et al, 2010)) associata a sintomatologia che non supporta una grave sepsi (solitamente segni clinici di lieve – moderata entità aspecifici come ipertermia, inappetenza, abbattimento oppure soggetti asintomatici che risultano neutropenici come reperto occasionale); left shift o segni di tossicità citoplasmatica possono essere presenti in particolar modo se vi sono infezioni concomitanti (non improbabili e secondarie alla neutropenia);
• Esclusione di tutte le altre cause di neutropenia, comprese cause che possano secondariamente dare una neutropenia immunomediata (neoplasie, somministrazione di farmaci, agenti infettivi come ad esempio infezione da Anaplasma phagocytophilum);
• Rapida risposta ai corticosteroidi, con aumento sostanziale del numero dei granulociti neutrofili, secondo alcuni Autori entro due settimane dall’inizio della terapia (Devine et al, 2017), secondo altri già dopo 2-3 giorni (Weiss at al, 2010).

La citologia midollare solitamente evidenzia una iperplasia mieloide a dimostrazione della distruzione periferica, ma sono riportati anche un numero di casi più ridotto in cui si segnala una ipoplasia – aplasia mieloide con arresto maturativo, suggerendo una distruzione sui precursori (in un gatto con neutropenia immunomediata la citologia midollare indicava una grave ipoplasia mieloide (Waugh et al., 2014)).

Sono state indagate diverse metodiche diagnostiche per la ricerca di anticorpi anti- neutrofili quali citofluorimetria, immunofluorescenza, leucoagglutinazione, RIA, ma nessuna di queste ha dimostrato una reale utilità diagnostica; ad oggi è una diagnosi presuntiva a cui si giunge solamente per esclusione di altre cause e per la risposta alla terapia.

La neutropenia causata da sindrome emofagocitica è una condizione rara secondaria ad un disturbo proliferativo dei macrofagi attivati che agiscono a livello midollare o splenico causando citopenie periferiche (non solo neutropenia); in letteratura tale sindrome non è unanimemente classificata e viene considerata secondaria a patologie immunomediate, infettive, disordini mielodisplasici – neoplastici o primaria di origine idiopatica (Weiss et al, 2007; Wilkinson et al., 2014).

Ridotta produzione midollare

Questo tipo di neutropenia si presenta nel momento in cui sono presenti un danno ai precursori mieloidi, un’alterazione a livello di microambiente midollare oppure un disturbo maturativo. A differenza delle forme infiammatorie, solitamente a livello periferico non sono presenti left shift e tossicità citoplasmatica, a meno che non vi siano infezioni secondarie; a livello citologico midollare si evidenzia un’ipoplasia mieloide, e più spesso la maturazione è ordinata con presenza di tutti gli stadi. Possono essere presenti più citopenie se il danno al midollo interessa tutte e tre le linee.

La riduzione della produzione midollare può essere secondaria a:

• Somministrazione di chemioterapici: Sia nel gatto che nel cane, come nell’uomo, è riportato questo tipo di neutropenia: i chemioterapici citotossici hanno come target le cellule ad elevata replicazione come lo sono le cellule ematopoietiche e la mielosoppressione è solitamente dose dipendente; questo tipo di condizione è riportata più frequentemente sia nel cane che nel gatto in corso di protocollo chemioterapico per linfoma (Pierro et al, 2016; Sorenmo et al., 2010). Inaspettatamente è stato dimostrato che in corso di linfoma nel cane la neutropenia indotta da chemioterapia sia un marker prognostico favorevole (Wang et al, 2015);
• Reazioni idiosincrasiche da farmaco, ovvero non dose dipendenti ma legati a una predisposizione individuale del paziente a produrre dei metaboliti reattivi che causano stress ossidativo e/o evocano una reazione immunitaria umorale o cellulo-mediata. Premesso che qualsiasi farmaco può indurre tale effetto, ricordiamo alcuni di quelli riportati in medicina veterinaria: fenobarbitale, fenilbutazone, trimetoprim/sulfamidici, griseofulvina, cefalosporine, fenbendazolo, cloramfenicolo;
• Estrogeni sia endogeni (in corso di Sertolioma del cane) sia esogeni (in corso di trattamento per iperplasia prostatica, incontinenza urinaria in femmine sterilizzate o come cura per l’infertilità);
• Patologie virali: in corso di FeLV la neutropenia è un riscontro frequente (Weiss at al, 2010), e alcuni case reports dimostrano talvolta una risposta ai corticosteroidi (Stavroulaki et al, 2020)); la neutropenia è segnalata anche in corso di FIV, parvovirosi (cane e gatto, eziologia multifattoriale) e cimurro.
• Patologie da vettore croniche: Ehrlichia e Leishmania spp. (solitamente sono presenti citopenie multiple);
• Mieloftisi: è più comune che si associ ad una pancitopenia ma, per una questione di emivita, può comparire per prima la neutropenia. Con mieloftisi si intende la sostituzione del midollo osseo da parte di un altro tessuto conseguente a infiltrazione di altre cellule in corso di neoplasie primarie del midollo (linfoidi (Museux et al., 2019), mieloidi, mieloma multiplo) o secondarie (ad esempio linfoma V stadio, carcinoma e mastocitoma metastatici). Tra le cause di mieloftisi ricordiamo anche la mielofibrosi (sostituzione di tessuto emopoietico con tessuto connettivo).
• Necrosi midollare.

Ematopoiesi ciclica

È una malattia congenita autosomica recessiva segnalata nei Gray Collie, data da una mutazione del gene AP3B1 che provoca un’ematopoiesi ciclica con interessamento di granulociti neutrofili, eritrociti, piastrine e monociti. La ciclicità nella produzione dei granulociti neutrofili circolanti viene scandita da intervalli di circa 12-14 giorni: in alcuni momenti la conta dei neutrofili è azzerata e persiste per circa 2-4 giorni. La conta dei neutrofili nel sangue torna alla normalità o addirittura aumenta nel periodo successivo alla neutropenia.

Dismielopoiesi e sindrome mielodisplastica

Queste patologie sono caratterizzate da citopenie periferiche associate a un quadro midollare di iperplasia delle linee coinvolte, con presenza di segni di displasia. Sono condizioni abbastanza rare, riportate sia nel cane che nel gatto, e possono essere sia primarie (pre - neoplastiche) che secondarie a qualsiasi patologia che danneggi il midollo impedendo una corretta maturazione delle linee cellulari.

Gli Outliers e gli intervalli di riferimento di razza

Quando riscontriamo una neutropenia di lieve - moderata entità, in assenza di sintomatologia clinica e altre alterazioni clinico-patologiche dobbiamo considerare la possibilità che il paziente sia un outlier, vale a dire un individuo sano che ha un numero di neutrofili inferiore alla popolazione di riferimento (il 5% dei soggetti ha valori che cadono sopra o sotto i valori di popolazione di qualsiasi test, per come vengono costruiti gli intervalli di riferimento). Come possiamo individuare questi outliers? Se l’alterazione persiste nel tempo (se disponibili possiamo cercare esami precedenti), il paziente resta clinicamente sano e con altri esami normali e possiamo escludere patologie subcliniche (esempio FIV e FeLV, alcune malattie da vettore nel cane) è ragionevole pensare che possa essere un outlier. Inoltre, vi sono alcune razze come i Grayhound che presentano fisiologicamente la conta dei neutrofili inferiore rispetto alle altre (Campora et al, 2011).

In sintesi, quale approccio diagnostico possiamo utilizzare in caso di neutropenia?

• Ripetiamo il campionamento sia per escludere un possibile errore pre - analitico sia per verificare se la neutropenia è persistente, ingravescente, se compaiono altre citopenie, o se i leucociti rientrano nell’intervallo di normalità;
• Se la neutropenia è lieve - moderata e si conferma nel tempo in soggetti clinicamente sani e in assenza di qualsiasi altra alterazione clinico-patologica, consideriamo la possibilità che il nostro paziente sia un outlier (sano ma con 1 parametro al di fuori degli intervalli di normalità di popolazione);
• Indaghiamo in anamnesi se vaccinazioni e profilassi sono state eseguite correttamente e se il paziente può aver assunto farmaci;
• Attraverso visita clinica, diagnostica per immagini e altri esami clinico-patologici ricerchiamo la eventuale presenza di focolai settici o flogosi sistemica (o qualsiasi altro sintomo che possa orientarci tra le diagnosi differenziali sopra elencate);
• Valutiamo lo striscio ematico: la presenza di left shift (soprattutto degenerativo) associata a grave tossicità citoplasmatica (basofilia, vacuolizzazioni, corpi di Dohle) orienta più verso un aumentato consumo tissutale (sepsi); non dimentichiamo che tali aspetti potrebbero essere presenti anche nelle forme da aumentata distruzione periferica o ridotta produzione nel caso in cui a seguito della neutropenia si sia instaurato un processo settico. Diciamo quindi che NON osservare left shift e tossicità citoplasmatiche può essere utile per escludere con buona probabilità una neutropenia infiammatoria o da endotossemia. Valutiamo sempre anche le proteine di fase acuta (ad esempio la proteina C reattiva  nel cane e l'amiloide sierica nel gatto) e il tracciato elettroforetico alla ricerca di segni di flogosi (aumento della frazione alfa2 per flogosi acuta, delle globuline per flogosi cronica);
• Se in anamnesi è riportata una mancata profilassi per ectoparassiti e se il soggetto vive o è stato in aree endemiche, è necessario escludere le malattie infettive mediante esami sierologici (nel cane Ehrlichia o Leishmania spp. se la clinica suggerisce una sintomatologia cronica, nel gatto FIV e FeLV) oppure mediante biologia molecolare (ed esempio Anaplasma phagocytophilum o Babesia spp. se invece la sintomatologia clinica appare acuta);
• L’esame citopatologico del midollo osseo è consigliato in caso di neutropenia persistente e-o ingravescente (soprattutto se associata a altre citopenie) in assenza di evidenti focolai settici.

Dr.ssa Silvia Rossi, DVM Dipl. ECVCP - Dr.ssa Giulia Mangiagalli, DVM

Bibliografia:

• Schultze. Chapter 48: Interpretation of Canine Leukocyte Responses. In: Schalm’s Veterinary Hematology. Sixth edition. 2010
• Valenciano et al. Chapter 49: Interpretation of Feline Leukocyte Responses. In: Schalm’s Veterinary Hematology. Sixth edition. 2010
• Harvey. Chapter 5: Evaluation of leukocytic disorders. In: Veterinary Hematology, a Diagnostic Guide and Color Atlas. First Edition. 2012
• Stockham, Scott. Chapter 2: Leukocytes. In: Fundamentals of Veterinary Clinical Pathology. Second Edition. Blackwell Publ. Ames. 2008
• Schnelle et al. Neutropenia in dogs and cats: causes and consequences. Vet Clin Small Anim 42. 111–122. 2012
• Zandecki et al. Spurious counts and spurious results on haematology analysers: a review. Part II: white blood cells, red blood cells, haemoglobin, red cell indices and reticulocytes. International Journal of Laboratory Hematology. 2007
• Waugh et al. Primary immune-mediated neutropenia in a cat. Can Vet J;55:1074–1078. 2014
• Devine et al. Presumed primary immune-mediated neutropenia in 35 dogs: a retrospective study. Journal of Small Animal Practice. 58, 307–313. 2017
• Weiss et al. Hemophagocytic syndrome in dogs: 24 cases (1996–2005), JAVMA, Vol 230. 2007
• Wilkinson et al. Hemophagocytic syndrome in a cat. Journal of Feline Medicine and Surgery Open Reports. 1–5. 2018
• Pierro et al. Febrile neutropenia in cats treated with chemotherapy. Veterinary and Comparative Oncology. 2016
• Wang et al. Chemotherapy-induced neutropenia is associated with prolonged remission duration and survival time in canine lymphoma. The Veterinary Journal 205. 69–73. 2015
• Sorenmo et al. Case-control study to evaluate risk factors for the development of sepsis (neutropenia and fever) in dogs receiving chemotherapy. JAVMA, Vol 236, No. 6. 2010
• Museux et al. Chronic lymphopenia and neutropenia in a dog with large granular lymphocytic leukemia. Vet Clin Pathol. 48:721–724. 2019
• Stavroulaki et al. Steroid-responsive neutropenia in a cat with progressive feline leukemia virus infection. Vet Clin Pathol. 49:389–393. 2020
• Swenson et al. Cyclic hematopoiesis associated with feline leukemia virus infection in two cats. J Am Vet Med Assoc. 191(1):93-6. 1987
• Campora et al. Determination of haematological reference intervals in healthy adult greyhounds. Journal of Small Animal Practice. 52, 301–309. 2011

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La misurazione degli acidi biliari

Gli acidi biliari sono steroidi sintetizzati dagli epatociti a partire dal colesterolo ed escreti nella bile; nell’intestino emulsionano i grassi e facilitano l’assorbimento dei nutritivi.

Circolo enteroepatico

Per poter comprendere il significato di questo test è indispensabile conoscere questo “virtuoso” ricircolo.

A livello epatico il colesterolo viene degradato a acidi biliari primari (++ colico e chenodesossicolico); questi vengono quindi coniugati a glicina, taurina, acido glicuronico e solfati e escreti nella bile come acidi biliari coniugati, secondo gradiente osmotico. A livello intestinale questi vengono riassorbiti mediante trasporto attivo per il 90% circa (soprattutto nell’ileo ma anche in ceco e colon). Il rimanente 10% può venire o deconiugato dai batteri e passivamente riassorbito a livello del colon oppure deidrossilato sempre dai batteri a acidi biliari secondari (che possono essere riassorbiti oppure persi con le feci). Una volta assorbiti a livello intestinale gli acidi biliari attraverso il circolo portale arrivano al fegato che li riassorbe per il 95%; il rimanente 5% è ciò che misuriamo in un animale sano. Quando la cistifellea si contrae (in risposta all’arrivo del chimo nel tratto digestivo, ma anche spontaneamente) aumenta la quantità di acidi biliari escretati nell’intestino e di conseguenza aumenta la quantità di acidi biliari che entrano nel sistema portale, diretti al fegato; anche in condizioni fisiologiche è così possibile osservare dopo questo evento un loro transitorio aumento sierico (in condizioni fisiologiche può arrivare fino a 3 volte il valore dei basali a digiuno)  prima che gli epatociti ricaptino questa ondata.

Quando e perché misurare gli acidi biliari sierici?

 La misurazione degli acidi biliari ci consente di verificare se i vari passaggi del loro metabolismo sono intatti. Nel dettaglio possiamo capire se sono presenti:

1. RIDUZIONE DELLA MASSA E/O DELLA FUNZIONALITA’ EPATOCELLULARE: gli epatociti non funzionanti non possono metabolizzare o riassorbire gli acidi biliari dal circolo entero-epatico che quindi restano alti nel siero
2. ALTERAZIONE DEL CIRCOLO ENTEROEPATICO: gli acidi biliari sierici si accumulano nel siero:
   • per diminuito flusso portale al fegato (ad es. in corso di shunt portosistemico (PSS), il flusso ematico bypassa il fegato e riversa gli acidi nel circolo sistemico)
   • Per ostruzione delle vie biliari o per colestasi (gli acidi biliari non vengono escretati nell’intestino con la bile e ritornano indietro, fino ad essere rilasciati nel circolo sistemico)

Quindi il test va richiesto in caso di:

• sospetta insufficienza epatica (non epatopatia! come spiegato nella pillola precedente);
• sospetto PPS (anche per monitoraggio chiusura PSS).

In tutti i casi, in assenza di ittero - colestasi (vedi poi).

Tipi di test e modalità di esecuzione

1. Random test: gli acidi biliari possono essere misurati in qualunque momento della giornata. Test meno utile tra i vari, esiste ben poca letteratura a riguardo;
2. Acidi biliari pre-prandiali. Il prelievo viene effettuato dopo 12 ore di digiuno;
3. Challenge test o test da carico (pre e post-prandiali): dopo aver effettuato il prelievo a T0 (pre-prandiale dopo digiuno di 12 ore) si somministra un piccolo pasto grasso o ricco di proteine (non c’è un singolo protocollo condiviso in letteratura ma noi consigliamo 2 cucchiaini per cani piccola taglia, 2 cucchiai per cani grossa taglia) e si ripete un prelievo dopo circa 2 ore da questo. Questo è il test più informativo tra i tre, con la migliore accuratezza diagnostica. L’assunzione di cibo provoca la contrazione della colecisti e il rilascio degli acidi biliari nell’intestino; un eccessivo aumento del valore degli acidi post-prandiali significa che c’è una ostruzione biliare (o colestasi) e dalla colecisti questi non potendo arrivare all’intestino tornano indietro fino a essere “rigurgitati” nel circolo ematico sistemico, oppure che dal circolo portale non vengono riassorbiti dal fegato (presenza di PSS oppure ipofunzionalità epatocitaria).

Interferenze analitiche e stabilità del campione

LIPEMIA ED EMOLISI interferiscono con la lettura ottica dello strumento determinando rispettivamente falsi aumenti e false diminuzioni.

L’ITTERO invece non rappresenta un interferente sensu stricto ma in sua presenza diventa quasi del tutto inutile misurare gli acidi biliari. Se un paziente presenta ittero soprattutto epatico o post epatico, è certo che gli acidi biliari (random, pre e post) saranno elevati; questo perché l’iperbilirubinemia ci sta già dicendo che o il fegato non funziona (ittero epatico) o che è presente colestasi (ittero post-epatico) e in entrambe queste situazioni gli acidi biliari aumentano: se aumenta la bilirubina nel sangue, parallelamente aumentano gli acidi biliari che seguono le stesse vie metaboliche.

Il siero (non emolitico, non lipemico) deve essere conservato refrigerato o congelato se non può essere processato in giornata.

Cause di aumento (di uno qualsiasi dei test utilizzati, sebbene con accuratezze variabili)

1. Ipofunzionalità epatocitaria – insufficienza epatica: gli epatociti non sono in grado di metabolizzare o estrarre dal circolo portale gli acidi biliari.
2. Anomalie del circolo portale: in presenza di PSS o displasia microvascolare, il sangue del sistema portale bypassa il fegato così che gli epatociti anche se funzionanti, non posso ricaptare gli acidi biliari in arrivo dall’intestino; queste anomalie vascolari con il passare del tempo esitano in insufficienza epatica.
3. Colestasi: qualsiasi condizione che causi un rallentamento o un ostacolo al flusso della bile provoca un aumento degli acidi biliari, sia in caso di colestasi strutturale che funzionale. Nel caso in cui sia già nota la presenza di colestasi (aumento bilirubina, marcato aumento ALP e GGT, aumento colesterolo, immagini ecografiche di ostruzione delle vie biliari etc) non è utile misurare gli acidi biliari perché già sappiamo che saranno elevati.
4. Altre cause: sfortunatamente aumenti (soprattutto lievi) dei livelli sierici degli acidi biliari non solo non sono specifici per una singola patologia epatica (insufficienza, anomalie vascolari, colestasi) ma possono verificarsi in pazienti in assenza di patologia epatica (ad esempio in corso di patologia dentale) o in pazienti con patologie primarie di altro tipo che solo secondariamente e lievemente coinvolgono il fegato (es iperadrenocorticismo); un aumento fisiologico lieve può essere osservato anche in animali sani successivamente alla contrazione spontanea della cistifellea.

Problemi interpretativi

Purtroppo esistono numerose variabili che possono contribuire a ottenere risultati poco chiari e definitivi. Ecco alcuni esempi:

• Gli acidi biliari sierici (in particolare random e pre-prandiali) possono risultare normali in casi di insufficienze epatiche lievi (falsi negativi, bassa sensibilità).
• Una contrazione spontanea della colecisti che può avvenire in qualsiasi momento può interferire nei seguenti modi:
  • Fa aumentare gli acidi biliari sierici anche in assenza di patologia epatica (se avviene 1-2 ore prima del nostro prelievo);
  • Se avviene prima della somministrazione del pasto, la colecisti sarà vuota quando effettuiamo il test da carico e possiamo ritrovarci un valore pre-prandiale superiore ad un post-prandiale. In questi casi piuttosto comuni molti autori suggeriscono di considerare comunque patologico il valore pre-prandiale (nel caso sia marcatamente aumentato, non solo lievemente).
• Un rallentato o aumentato transito gastrointestinale possono modificare i tempi di contrazione della cistifellea per cui, quando noi effettuiamo il prelievo post-prandiale, questa potrebbe o non esserci ancora contratta o essersi già contratta da tempo.
• La colecisti può contrarsi in risposta al pasto in modo incompleto e non riversare il suo contenuto nel duodeno.
• Gravi patologie intestinali associate a malassorbimento possono diminuire l’assorbimento degli acidi biliari e quindi alterarne il circolo entero-epatico (Giaretta et al 2018).
• I cani di razza Maltese hanno un livello di acidi biliari sierici più elevato rispetto a cani di altre razze, sebbene non sia del tutto chiaro se questo si associa a patologie epatiche sottostanti di razza o sia presente sempre e comunque anche in pazienti sani. (O’Leary et al., 2014; Tisdall et al, 1994).

Acidi biliari urinari normalizzati creatinina

Fisiologicamente solo piccole quantità di acidi biliari in forma sulfatata (USBA), non sulfatata (UNSBA) e mista (USBA e UNSBA) vengono escrete con le urine (quelli che “sfuggono” alla circolazione enteroepatica).

Nel caso aumentino nel siero, ne aumenta la quota eliminata con le urine: la normalizzazione con la creatinina serve ad aggiustare la loro concentrazione rispetto al peso specifico urinario, come avviene per esempio per la protenuria. Questo test, poiché misura la concentrazione sierica media delle ore precedenti, non risente di eventuali contrazioni spontanee della colecisti. Purtroppo, gli studi riportati in letteratura sono datati e scarsi (Balkman  et al., 2003 e Trainor  et al., 2003) e dopo la loro pubblicazione non ne sono seguiti altri. Oltre a mancare dati scientifici (anzi forse proprio per questo) raramente questo test viene consigliato dalle review di epatologia né viene nominato da autorevoli relatori che presentano sull’argomento. Da un punto di vista tecnico inoltre utilizzare un reagente che funziona su siero su un altro tipo di matrice (le urine) crea sempre notevoli problemi analitici, rendendo talvolta inaccurate le determinazioni. Per tutte queste ragioni il nostro laboratorio sconsiglia l’utilizzo di questo test.

In considerazione del fatto che interpretare i risultati di questo test può essere talvolta complesso vogliamo dare alcuni suggerimenti finali e generali:

• Selezionare sempre il meglio possibile i pazienti da sottoporre al test: sospetta insufficienza epatica, sospette anomalie del circolo portale (PSS, anomalie del microcircolo).
• Utilizzare il test da carico poiché è il test con la maggiore sensibilità: se utilizziamo test random o solo pre-prandiale è più probabile ottenere un falso negativo (soprattutto in corso di patologia lieve).
• Per poter interpretare correttamente i risultati di questo test in considerazione del fatto che aumentano in corso di diverse condizioni è indispensabile utilizzare tutti i dati clinico patologici, i reperti di diagnostica per immagini, unitamente ad anamnesi e clinica; si ricorda infine che non è raro dover arrivare all’esame istopatologico del fegato per poter formulare una diagnosi definitiva.
• Gli intervalli di riferimento di questo test devono essere considerati indicativi: a causa della grande variabilità individuale e dei vari problemi interpretativi sono più informativi marcati aumenti o valori decisamente “normali” mentre tutti i risultati intorno ai valori superiori degli intervalli di riferimento devono essere considerati dubbi.
• Nel caso in cui il risultato pre-prandiale sia marcatamente aumentato e maggiore del post-prandiale (possibile nel caso di contrazione spontanea della colecisti precedente al prelievo pre-prandiale, oppure per rallentato svuotamento gastrico), molti Autori consigliano di considerare comunque patologico il risultato.
• In caso di sospetto PSS, gli acidi biliari pre-prandiali hanno una sensibilità molto elevata ma una bassa specificità: un risultato negativo esclude con elevata probabilità il sospetto, mentre un risultato positivo deve essere approfondito con altri test (possibile falso positivo)

Dr.ssa Silvia Rossi, DVM dipl. ECVCP

Bibliografia:

• Balkman CE et al. Evaluation of urine sulfated and nonsulfated bile acids as a diagnostic test for liver disease in dogs. J Am Vet Med Assoc 222(10) :1368-1375, 2003
• Eclinpath.com. https://eclinpath.com/chemistry/liver/liver-function-tests/bile-acids/ Ultimo accesso 25 ottobre 2020.
• Giaretta PL et al. Comparison of intestinal expression of the apical sodium-dependent bile acid transporter between dogs with and without chronic inflammatory enteropathy. J Vet Intern Med 32(6): 1918-1926, 2018
• Lawrence YA and Steiner JM. Laboratory evaluation of the liver. Vet Clin North Am Small Anim Pract 47(3): 539-553, 2017
• Ruland K et al. Sensitivity and specificity of fasting ammonia and serum bile acids in the diagnosis of portosystemic shunts in dogs and cats. Vet Clin Pathol 39(1):57-64, 2010
• Stockham L, Scott MA. Liver Function. In: Fundamentals of Veterinary Clinical Pathology. Second Edition. Blackwell Publ. Ames. 675-706, 2008.
• Trainor T et al. Urine sulfated and nonsulfated bile acids as a diagnostic test for liver disease in cats. J Vet Intern Med17(2): 145-153, 2003
• Van Straten G et al. Diagnostic value of the rectal ammonia tolerance test, fasting plasma ammonia and fasting plasma bile acids for canine portosystemic shunting. Vet J 204(3): 282-286, 2015
• O'Leary CA et al. The inheritance of extra-hepatic portosystemic shunts and elevated bile acid concentrations in Maltese dogs. J Small Anim Pract. 2014 Jan;55(1):14-21.
• Tisdall PL, et al Post-prandial serum bile acid concentrations and ammonia tolerance in Maltese dogs with and without hepatic vascular anomalies. Aust Vet J. 1995 Apr;72(4):121-6.

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Leucocitosi Neutrofila Estrema e Reazione Leucemoide

Nella nostra routine di laboratorio accade con discreta frequenza che i Colleghi referenti sospettino una forma leucemica di fronte a emogrammi con leucocitosi neutrofile importanti.

Poiché le leucemie mieloidi (granulocitiche) croniche sono estremamente rare, abbiamo pensato che potesse essere utile ripassare insieme le principali e più probabili diagnosi differenziali in corso di questa condizione. 

DEFINIZIONI

Leucocitosi Neutrofila Estrema

Con il termine leucocitosi neutrofila estrema si indica, secondo alcuni testi, una leucocitosi superiore a 50.000 – 100.000 cellule/microlitro delle quali i granulociti neutrofili rappresentino almeno un numero superiore a 25.000/uL (Harvey JV, 2012); secondo altri testi i granulociti neutrofili devono essere superiori a 50.000/uL. (Weiss, 2010).

Reazione leucemoide

Si tratta di una leucocitosi neutrofila estrema (superiore a 50-100.000 cellule/uL) con prevalenza di neutrofili maturi ma contemporanea presenza per lo più ordinata di forme immature: ordinata nel senso che sono presenti molti bandati, occasionali metamielociti, rari mielociti. La presenza delle forme immature pone come diagnosi differenziale morfologica quella di leucemia ma la causa di questa leucocitosi è sempre infiammatoria o paraneoplastica e NON imputabile ad una forma leucemica mieloide.

Le diverse diagnosi differenziali di una leucocitosi neutrofila estrema (con o senza left shift) includono:

• Lesioni suppurative batteriche localizzate: piometra, pioaddome, piotorace, pielonefrite, ascessi, empiemi etc;
• Disordini immunomediati: anemia emolitica immunomediata (IMHA), vasculite, glomerulonefrite, poliartite, etc;
• Necrosi: lesioni necrotiche localizzate conseguenti a fenomeni trombotici o alterazioni di circolo, neoplasie con centro necrotico, traumi, pancreatiti, peritonite biliare;
• Malattie da vettore: segnalato un cane con polimiosite granulomatosa da infezione da Hepatozoon americanum (Gaunt et al., 1983) e due cani con infezione da Babesia canis (Lobbetti et al., 1995).
• Deficit di adesione leucocitaria (leukocyte adhesion deficiency): riportata nel setter irlandese rosso - bianco e in un case report di un gatto comune europeo (Bauer et al., 2017). È una rara malattia congenita autosomica recessiva caratterizzata dalla mutazione di un gene che codifica l’integrina CD18, molecola di adesione presente sulla membrana leucocitaria. La mutazione impedisce quindi il complesso CD11/CD18, causando difetti nell’adesione e migrazione nei tessuti dei leucociti; i soggetti affetti presentano leucocitosi persistenti e maggiore suscettibilità alle infezioni.
• Dermatosi sterile neutrofilica canina (Sweet’s syndrome like) (Hammes et al., 2019): rara sindrome (segnalata solo in 8 cani) caratterizzata da leucocitosi neutrofilica estrema associata a ipertermia, lesioni cutanee con infiltrazione neutrofilica del derma (papule eritematose, placche e noduli) con coinvolgimento sistemico e risentimento epatico e renale. La rapida risposta alla terapia corticosteroidea supporta un’eziologia multifattoriale da deposito di immunocomplessi, anticorpi circolanti e citochine pro – infiammatorie.

In corso di queste condizioni patologiche, alla valutazione dello striscio ematico la neutrofilia appare per lo più matura, associata a left shift ordinato caratterizzato dalla prevalenza di granulociti neutrofili a banda, occasionali – rare forme più immature come metamielociti, promielociti e mielociti; la tossicità citoplasmatica può essere assente ed è più probabile sia presente in corso di infezioni batteriche.

• Sindrome paraneoplastica: segnalata sia nel cane che nel gatto in corso di differenti neoplasie come carcinoma (Sharkey et al., 1996), di origine mammaria (Jark et al., 2015), adenocarcinoma polmonare (Dole et al., 2004), polipo adenomatoso rettale (Thompson et al., 1992), linfoma e mastocitoma. La leucocitosi è secondaria a focolai necrotici presenti all’interno delle neoplasie e-o alla produzione da parte delle cellule tumorali di granulochine (G-CSF e GM-CSF) o sostanze simili stimolanti la crescita granulocitaria. Solitamente sono leucocitosi ingravescenti e persistenti, più spesso mature in assenza di left shift.

Leucemia granulocitica cronica (CML)

È una patologia estremamente rara, riportata nel cane e ancor più raramente nel gatto. Oltre al numero dei granulociti neutrofili possono essere aumentati anche i granulociti eosinofili, basofili e-o i monociti. Il numero totale dei granulociti neutrofili è marcatamente aumentato e alla valutazione dello striscio ematico è più probabile osservare un left shift disordinato (non piramidale come in corso di reazione leucemoide infiammatoria) insieme ad anomalie morfologiche dei neutrofili (displasia, nuclei ad anello, asincronia maturativa). Tali leucemie croniche possono evolvere in crisi blastica (fase di acutizzazione di una leucemia cronica) ove aumentano in numero o predominano blasti mieloidi sia a livello periferico che a livello midollare.

Per destreggiarsi tra queste diagnosi differenziali, l’iter deve essere sistematico e metodico, associando al dato clinico- patologico, anche i dati clinici, anamnestici e di diagnostica per immagini.

• Anamnesi e segnalamento: valutare se in anamnesi sono riportate suscettibilità alle infezioni sin da cuccioli e se il paziente rientra tra le razze in cui è stato riportato un deficit di adesione leucocitaria. Le forme leucemiche croniche sono nella loro rarità più probabili in pazienti anziani ed estremamente improbabili nei giovani;
• Visita clinica e diagnostica per immagini: è indispensabile riscontro di segni di flogosi/sepsi (ipertermia, inappetenza, abbattimento…), fenomeni tromboembolici, focolai settici, necrotici, presenza di neoformazioni, alterazioni d’organo etc;
• Dati clinico – patologici: la valutazione dello striscio ematico può aiutare a orientarsi: nelle forme infiammatorie – infettive è più probabile osservare segni di tossicità moderata – grave e left shift ordinato. Sempre attraverso la valutazione dello striscio è possibile identificare alterazioni compatibili con IMHA (es. agglutinazione, sferocitosi) o la presenza di agenti infettivi (es. Hepatozoon spp. e Babesia spp.) a giustificare la leucocitosi marcata. Infine, iperprotidemia, ipoalbuminemia, aumento della frazione alfa2 del tracciato elettroforetico e aumento delle proteine di fase acuta come proteina C reattiva (cane) e amiloide sierica (gatto) sono più probabili in corso di flogosi – sepsi, sebbene raramente possano aumentare in corso di CML o in presenza di comorbidità.
• Emocoltura: questo esame deve essere eseguito per escludere una setticemia, in caso in cui non si evidenzino dei focali batterici ma persista il sospetto di sepsi (es: endocardite). Si rimanda al seguente link per ulteriori informazioni sulla metodica di prelievo e tempi di sospensioni degli antibiotici. https://www.biessea.com/essential_grid/batteriologia/
• Esame citologico del midollo osseo: questo esame ha un valore diagnostico limitato nella diagnosi differenziale della leucocitosi neutrofilica estrema: da un punto di vista citologico, il midollo presenta in entrambe le condizioni un’iperplasia della linea mieloide. Nel caso di CML si possono osservare segni di displasia a carico sia dei granulociti neutrofili sia delle forme più immature e, in caso di crisi blastica, la predominanza di blasti mieloidi.
• La diagnosi di CML è una diagnosi di esclusione: se è possibile escludere che siano presenti una patologia infiammatoria-infettiva o una neoplasia non ematologica e se la leucocitosi neutrofila estrema è persistente e ingravescente, è possibile emettere tale diagnosi con ragionevole confidenza.

Dr.ssa Silvia Rossi, DVM Dipl ECVCP – Dr.ssa Giulia Mangiagalli, DVM

Bibliografia:

• Weiss DJ, Wardrop KJ. Schalm’s Veterinary Hematology. Sixth edition. 2010
• Harvey JV Veterinary Hematology, a Diagnostic Guide and Color Atlas. First Edition, 2012
• Lucroy et al. Clinical outcome and diseases associated with extreme neutrophilic leukocytosis in cats: 104 cases (1991–1999). JAVMA, Vol 218, 2001
• Bauer et al. Feline leukocyte adhesion (CD18) deficiency caused by a deletion in the integrin beta-2 (ITGB2) gene: Feline leukocyte adhesion deficiency. Vet Clin Pathol. 2017
• Gaunt et al. Extreme neutrophilic leukocytosis in a dog with hepatozoonosis. J Am Vet Med Assoc. 1983 Feb 15;182(4):409-10.
• Lobbetti et al. Leukaemoid response in two dogs with Babesia canis infection. J S Afr Vet Assoc.1995 Sep;66(3):182-4.
• Sharkey et al. Production of granulocyte colony-stimulating factor and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by carcinomas in a dog and a cat with paraneoplastic leukocytosis. J Vet Intern Med. 1996;10:405-408.
• Hammes et al. Canine sterile neutrophilic dermatosis (resembling Sweet’s syndrome) with severe extracutaneous manifestations. Band 161, Heft 4, April 2019, 231–238,
• Thompson et al. Paraneoplastic leukocytosis associated with a rectal adenomatous polyp in a dog. J Am Vet Med Assoc. 1992;201:737-738.
• Dole et al. Paraneoplastic leukocytosis with mature neutrophilia in a cat with pulmonary squamous cell carcinoma. J Feline Med Surg. 2004;6:391-395.
• Jark et al. Paraneoplastic neutrophilic leukocytosis syndrome in a cat with recurrent mammary carcinoma. Journal of Feline Medicine and Surgery Open Reports. 2015

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Danno Epatocellulare, Colestasi ed Insufficienza epatica: facciamo un po’ di chiarezza

Molto spesso la diagnosi di una patologia epatobiliare è complessa e non priva di sfide, sia perché i segni clinici sono spesso aspecifici ed in molti pazienti la malattia può essere subclinica almeno in fase iniziale (ad esempio prima che si manifestino sintomi di insufficienza epatica ci deve essere una marcata riduzione di tessuto epatico funzionale) sia perché raramente è possibile una diagnosi specifica senza l'ausilio di una biopsia istologica. Talvolta nemmeno quest’ultima riesce ad individuare l’eziopatogenesi della condizione in atto. Esami emato-biochimici, esame delle urine, esami citologico ed istologico svolgono comunque un ruolo importante nella diagnosi: in questa pillola cercheremo di definire i principali processi che possono coinvolgere il parenchima epatico e di descrivere le principali alterazioni clinico-patologiche che si possono riscontrare.

DANNO EPATOCELLULARE

Le potenziali cause di danno epatocellulare sono davvero numerose e per un elenco dettagliato rimandiamo a testi di medicina interna.

Più in generale, indipendentemente dalla causa che li danneggia, gli epatociti possono andare incontro a necrosi (danno irreversibile) oppure subire un danno alla membrana cellulare (reversibile o irreversibile) e in entrambi i casi possono rilasciare i loro enzimi citoplasmatici nel torrente circolatorio. Per determinare la presenza e l’eventuale entità di un danno epatico vengono quindi misurate le attività di questi enzimi che sono presenti in alte concentrazioni negli epatociti: un aumento della loro attività sierica NON è dovuta ad un aumento della loro sintesi ma alla loro perdita attraverso le membrane cellulari danneggiate. In generale si considera lieve un aumento di 2-3 volte al di sopra dell’intervallo di riferimento, moderato di 4-5 volte e marcato di 10 volte. I livelli sierici degli enzimi dipendono sia dal numero di cellule coinvolte sia dalla gravità del danno, ma NON sono correlati né con la reversibilità o irreversibilità del danno né con la funzionalità epatica. Infatti, un danno epatocellulare acuto può determinare un aumento marcato degli enzimi sierici ma può essere reversibile, senza evidenti segni clinici e può non compromettere la funzionalità epatica; al contrario, in uno stadio terminale di insufficienza epatica si possono osservare solo lievi aumenti a causa di una marcata riduzione degli epatociti vitali.

ALT e AST

I principali enzimi conosciuti e studiati come marker di danno epatocellulare sono: alanina aminotransferasi (ALT o GPT) e aspartato aminotransferasi (AST o GOT).  Segnaliamo anche altri enzimi misurati più raramente quali sorbitolo deidrogenasi (SDH), glutammato deidrogenasi (GLDH), lattato deidrogenasi (LDH). Ad eccezione di SDH e GLDH (utilizzati per di più nei grossi animali), questi enzimi si trovano anche in altri tipi di cellule quindi il loro aumento non è sempre specifico di danno epatico.

L’ALT si trova in alte concentrazioni nel citoplasma (+++) e nei mitocondri degli epatociti ed in misura minore in altri organi tra i quali muscolo scheletrico e cardiaco, rene ed eritrociti (gatto). Viene utilizzata come marker più specifico di danno epatocellulare rispetto alla AST.

L’AST infatti è presente in quantità molto più significative nel muscolo scheletrico, poi in fegato (citoplasma e soprattutto nei mitocondri e quindi indica un danno epatocellulare potenzialmente più grave rispetto alla ALT), cervello, rene, eritrociti e muscolo liscio cardiaco. Un aumento di AST deve sempre essere interpretato insieme al valore di CK (creatinchinasi): un marcato aumento di entrambe a fronte di un aumento non solidale della ALT deve far pensare alla presenza di danno muscolare piuttosto che di danno epatocellulare.

COLESTASI

Per definizione, con colestasi si intende un’interruzione o riduzione del flusso biliare nei canalicoli e/o cistifellea. Si distinguono due tipi di colestasi:

STRUTTURALE (impedimento fisico al flusso biliare)

• Intraepatica (con coinvolgimento dei canalicoli biliari e dell’area portale): aumento del volume degli epatociti (lipidosi epatica, grave epatopatia da corticosteroidi nel cane, diabete), gravi infiltrati cellulari di natura infiammatoria e neoplasie primarie o metastatiche, fibrosi, presenza di calcoli/fango biliare;
• Extraepatica (che coinvolge il sistema biliare extraepatico): flogosi (colangiti, pancreatite), neoplasie (pancreas, duodeno, vie biliari), presenza di calcoli/mucocele della cistifellea.

FUNZIONALE (infrequente nel cane, più frequente nel gatto)

In questo caso vi è una ridotta escrezione di bilirubina coniugata per un difetto nei trasportatori necessari per il trasporto attivo degli acidi biliari nei canalicoli; recenti studi indicano che anche nei problemi strutturali la colestasi possa essere dovuta ad un’insufficiente regolazione dei trasportatori. Endotossine batteriche (+++ Escherichia coli e Staphylococcus intermedius), farmaci, ormoni, citochine (TNFα, IL-6), accumulo di acidi grassi liberi possono causare una colestasi funzionale.

È importante sottolineare che in caso di colestasi funzionale potrebbero non riscontrarsi aumenti marcati degli enzimi inducibili ALP e GGT (vedi dopo).

ALP e GGT

I principali marker di laboratorio che possiamo misurare per diagnosticare una colestasi sono la fosfatasi alcalina (ALP) e la γ-glutamil transferasi (GGT). ALP e GGT sono enzimi presenti sulla membrana cellulare degli epatociti ma soprattutto delle vie biliari e sono enzimi “inducibili” (a differenza di ALT e AST), ovvero la maggiore attività sierica di questi enzimi è dovuta ad un aumento della loro sintesi. L’ALP è presente in diverse isoforme e si trova associata anche alle membrane cellulari in osso, rene, intestino, placenta ed in misura minima nei leucociti (monoblasti e granulociti eosinofili). SOLO NEL CANE inoltre esiste un’isoforma (C-ALP) indotta dai corticosteroidi (endogeni o esogeni). La GGT invece è presente anche in rene, pancreas, intestino, ghiandola mammaria ed epididimo; anch’essa può essere indotta dai corticosteroidi o da altri farmaci come gli anticonvulsivanti ma in misura nettamente inferiore rispetto a ALP. Sia ALP che GGT aumentano in corso di colestasi poiché l’aumentata pressione che si crea all’interno del sistema biliare induce iperplasia dell’epitelio biliare e di conseguenza un aumento della loro sintesi.

Per quanto riguarda il loro ruolo come marker di colestasi bisogna fare una distinzione tra cane e gatto:

• Cane: ALP ha una buona sensibilità (circa 85%) ma è meno specifico della GGT in quanto la sua attività può aumentare in corso di diverse altre condizioni, come ad esempio l’induzione da corticosteroidi. La GGT è molto più specifica e più sensibile per colestasi.
• Gatto: ALP ha una scarsa sensibilità poiché, avendo un’emivita molto breve in questa specie (poche ore) non si riscontrano aumenti marcati in corso di colestasi (fa eccezione la lipidosi, condizione in corso della quale ALP aumenta mentre GGT può essere normale), mente la GGT risulta più sensibile e specifica.

BILIRUBINA SIERICA E BILIRUBINURIA

La bilirubina (+++ coniugata) che non riesce ad essere escreta con la bile in corso di colestasi si accumula nel sangue e si riversa nelle urine. ALP e GGT hanno una maggiore sensibilità rispetto alla sola valutazione dei livelli di bilirubina sierica o bilirubinuria in corso di colestasi. L’aumento di bilirubina sierica come marker di colestasi oltre ad essere poco sensibile è inoltre poco specifica, poiché può aumentare sia in corso di ittero pre- epatico, vale a dire in seguito a emolisi gravi e acute, sia in corso di insufficienza epatica (ittero epatico, per incapacità del fegato di coniugare o “processare” la bilirubina).

Altre alterazioni clinico-patologiche (poco specifiche) che si possono riscontrare in corso di colestasi sono:

Ipercolesterolemia (per diminuita escrezione del colesterolo nella bile), assorbimento anormale della vitamina K con conseguente carenza dei fattori della coagulazione vitamina k-dipendenti (con allungamento dei tempi coagulativi), aumento della concentrazione degli acidi biliari.

INSUFFICIENZA EPATICA

L'insufficienza epatica rappresenta una grave compromissione della funzionalità epatica dovuta a una perdita superiore al 70-75% del tessuto funzionale epatico. Essa implica una sindrome clinica, cioè segni clinici correlati alla disfunzione epatica (es. encefalopatia epatica, diatesi emorragica, fotosensibilizzazione) e alterazioni degli esami di laboratorio conseguenti all’incapacità del fegato di produrre proteine, eliminare antigeni o altre sostanze tossiche dal sangue (es. ammoniaca, acidi biliari). In base al tempo che impiega il danno funzionale a verificarsi si parla di:

• INSUFFICIENZA EPATICA ACUTA: insorgenza acuta/improvvisa (da poche ore a pochi giorni) in assenza di patologie epatiche preesistenti. Tra le cause più comuni troviamo farmaci (es. paracetamolo, carprofen, fenobarbital nel cane e diazepam nel gatto, etc), tossine ambientali (es. amanita falloide e aflatossine nel cane, cycas, xylitolo), virus (Herpesvirus, CAV-1), agenti infettivi/endotossine (Leptospira, clostridi, Salmonella), neoplasie, ischemia, lipidosi. In generale la perdita di tessuto epatico funzionale è dovuta alla necrosi e alla risposta infiammatoria del sistema immunitario per il grave danno ossidativo e la produzione di metaboliti attivi.
• INSUFFICIENZA EPATICA CRONICA: insorgenza lenta (anche di mesi) secondaria ad una patologia epatica preesistente (es epatite cronica attiva, epatite cronica idiopatica o da accumulo di rame).

Quando sono presenti difetti di sintesi o comunque alterazioni di laboratorio che indicano una ipofunzionalità epatica ma non è ancora presente una insufficienza epatica con relativi segni e sintomi clinici è possibile parlare di disfunzione epatica. Un paziente può infatti presentare alterazioni clinico-patologiche suggestive di diminuita funzionalità senza avere una perdita del tessuto funzionale epatico maggiore del 70%; un classico esempio è lo shunt portosistemico in corso del quale possono essere presenti diminuzione dell’urea o aumento degli acidi biliari in assenza di insufficienza epatica.

I difetti di funzionalità epatica (in corso sia di disfunzione che di insufficienza epatica) possono essere sospettati in caso siano presenti le seguenti alterazioni clinico-patologiche (in particolar modo se sono presenti contemporaneamente alcune di esse):

• ↓ UREA: in seguito a diminuita sintesi a partire da ammonio e cataboliti azotati. Poiché l’urea contribuisce in larga misura a determinare la tonicità della midollare renale, una sua diminuzione comporta una ridotta capacità di concentrare le urine e di conseguenza la comparsa di PU/PD con diminuzione del peso specifico urinario.
• ↓ COLESTEROLO: per alterazione del metabolismo dei lipidi.
• ↓ ALBUMINA: in seguito a diminuita sintesi. Può anche diminuire in quanto proteina di fase acuta negativa se presente concomitante flogosi.
• ↓ GLUCOSIO per diminuzione della gluconeogenesi, delle riserve di glicogeno, per ritardo della clearance dell’insulina.
• ↑ BILIRUBINA TOTALE (ittero epatico): per diminuzione dell'uptake della bilirubina non coniugata, incapacità di coniugarla ed escretarla con la bile.
• ALTERAZIONI DEL PROFILO COAGULATIVO CON ↑ PT, ↑ aPTT, ↓FIB, ↓ATIII, ↑ DDIMERI, ↑ FdP: per minor sintesi epatica dei fattori (sia coagulativi che anticoagulanti), difetto di assorbimento della vitamina K (e conseguente mancata funzionalità dei fattori vitamina K dipendenti); una complicanza frequente in corso di insufficienza epatica è la DIC (coagulazione intravasale disseminata) come risultato finale delle alterazioni emostatiche presenti.
• ↑ ALT, ↑ AST, ↑ALP e ↑ GGT: SOLO ed ESCLUSIVAMENTE nel caso in cui siano presenti oltre alla disfunzione epatica, anche il danno epatocellulare (ad esempio nei casi di insufficienza epatica acuta) e/o la colestasi. È importante sottolineare che se in corso di insufficienza/disfunzione epatiche (soprattutto nel caso di condizioni ad insorgenza cronica) non è presente un danno epatocellulare contemporaneo e “attivo”, enzimi quali ALT, AST, ALP, LDH etc sono negli intervalli di riferimento. Viceversa, come già affermato in precedenza, è possibile che sia presente un severo danno epatocitario, magari localizzato, con marcato aumento di questi enzimi senza che sia presente un danno superiore al 70% della massa funzionale epatica (insufficienza epatica).
• ESAME DELLE URINE: ↓ peso specifico (per ridotta sintesi di urea), BILIRUBINURIA e presenza di CRISTALLI DI URATO D’AMMONIO, URATI AMORFI E ACIDO URICO (per le elevate concentrazioni di ammoniaca).

Bisogna sempre ricordare che queste alterazioni sono però poco sensibili e specifiche, vale a dire possono rispettivamente non essere presenti nelle forme iperacute o lievi e iniziali che ancora non hanno compromesso la maggior parte della massa funzionale epatica (bassa sensibilità) e possono essere riscontrate anche in corso di altre patologie (bassa specificità), soprattutto nel caso in cui si presentino isolatamente e non tutte insieme.

Altri test di funzionalità epatica che ci possono aiutare nella diagnosi di insufficienza epatica e dei quali parleremo nella prossima pillola di Patologia Clinica, sono:

• AMMONIEMIA: sensibilità molto alta per insufficienza epatica e shunt porto-sistemico ma campione instabile;
• ACIDI BILIARI: sensibilità alta per insufficienza epatica e shunt porto-sistemico.

Dr.ssa Silvia Rossi, DVM ECVCP dip. – Dr.ssa Marta Attini, DVM

BILIOGRAFIA

• https://eclinpath.com/chemistry/liver/
• DuHadway MR et al. Retrospective evaluation of xylitol ingestion in dogs: 192 cases (2007-2012). J Vet Emerg Crit Care (San Antonio) 25(5): 646-654, 2015
• Ferguson D et al. Survival and prognostic indicators for cycad intoxication in dogs. J Vet Intern Med.  25(4) :831-837, 2011
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Esame del liquido sinoviale nel cane e nel gatto

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Trombocitosi nel cane e nel gatto

Con trombocitosi si intende un numero di piastrine per microlitro superiore all’intervallo di riferimento. Questo dato deve essere confermato dalla valutazione microscopica dello striscio ematico: ad un aumento del numero di piastrine contato dallo strumento corrisponde in genere una stima piastrinica aumentata con un numero di piastrine per campo ad immersione 100x superiore a circa 30 (nel cane) e circa 48 (nel gatto) (Intervalli di riferimento secondo Stockham S, 2002). Nel caso in cui l’aumento del numero di piastrine sia lieve – moderato, la stima piastrinica potrebbe anche risultare normale. La conferma microscopica del dato strumentale è necessaria poiché le contaglobuli soprattutto a impedenza (più raramente laser) possono contare erroneamente come piastrine frammenti di eritrociti o di citoplasma di cellule nucleate circolanti, portando a una falsa sovrastima.  La trombocitosi può essere primaria o secondaria:

Trombocitosi primaria

Si tratta della trombocitemia essenziale (leucemia cronica delle piastrine), rara malattia mieloproliferativa che può essere diagnosticata soltanto escludendo tutte le cause secondarie di trombocitosi; l’esame citologico del midollo osseo non è risolutivo poiché rivela un’iperplasia megacariocitica, riscontrabile anche in altre condizioni neoplastiche oppure infiammatorie.

Trombocitosi secondaria

Le trombocitosi reattive sono le più comuni e possono essere secondarie a un ampio ventaglio di condizioni patologiche: neoplasie, infiammazioni, anemie immunomediate, traumi e anemia da carenza di ferro. Questi stati patologici causano il rilascio di citochine infiammatorie, come ad esempio di interleukina- 6, che aumentano la sintesi a livello epatico di una glicoproteina, la trombopoietina, che ha il compito di stimolare la proliferazione dei megacariociti e la successiva produzione di piastrine.  Anche l’eritropoietina sembrerebbe avere un parziale effetto di megacariopoiesi per cui nei casi di anemia con aumentata produzione di eritropoietina è possibile che anche la linea megacariocitica risponda diventando iperplastica. Il lavoro retrospettivo di Woolcock et al. (2017) su 715 cani con trombocitosi ha dimostrato che le cause più frequenti in questa specie sono neoplasie (soprattutto carcinomi e linfomi), stati infiammatori (patologie immunomediate, gastrointestinali ed epatobiliari) ed endocrinopatie (iperadrenocorticismo, diabete mellito e ipotiroidismo). Un lavoro meno recente su 165 cani di Neel et al. (2012) conferma le neoplasie come causa più frequente di trombocitosi (linfoma e mastocitoma sono le neoplasie più rappresentate), seguite da flogosi (soprattutto pancreatite, epatite cronica e IBD) e malattie endocrine (diabete mellito, iperadrenocorticismo e ipotiroidismo). Nel gatto le cause reattive più comuni sono le malattie infiammatorie ed infettive, soprattutto a carico dell’apparato gastroenterico.

Altre cause di trombocitosi secondaria meno frequenti possono essere:

• T. indotta da farmaco: alcuni farmaci chemioterapici come la doxorubricina possono dare effetto “rebound” del midollo osseo in seguito a una mielosoppressione, mentre la vincristina (utilizzata anche per il trattamento della trombocitopenia immunomediata) stimola direttamente la produzione e il rilascio di piastrine. Non è invece noto il meccanismo fisiopatologico secondario alla somministrazione di glucocorticoidi.
• T. post splenectomia: la milza contiene circa 1/3 della massa piastrinica e ha inoltre il compito di distruggere le piastrine “invecchiate” o danneggiate. In seguito a splenectomia è frequente riscontrare trombocitosi transitoria o persistente (anche della durata di diversi mesi) perché le piastrine perdono il loro sito di stoccaggio naturale e perché hanno una emivita maggiore per la mancata emocateresi.
• T. post trombocitopenia: dopo episodi di trombocitopenia è possibile osservare trombocitosi da “rebound” secondaria all’iperplasia megacariocitica che avviene in risposta all’aumento di tromboietina.

Trombocitosi e ipercoagulabilità

In letteratura veterinaria non è stata dimostrata un’associazione tra trombocitosi e fenomeni tromboembolici, sebbene sia stata sospettata. Un lavoro recente di Phipps et al. (2020) ha evidenziato che in cani splenectomizzati si può sviluppare uno stato di ipercoagulabilità (alterazioni del tromboelastogramma associate a marcata trombocitosi) nelle due settimane post-operatorie, ipotizzando un maggior rischio in questi soggetti di trombosi portali o polmonari, sebbene nessuno dei cani inclusi nello studio abbia sviluppato trombi. Perciò, non è chiaro se questa associazione (ipercoagulabilità – trombocitosi) esiti realmente in fenomeni tromboembolici.

Dr.ssa Silvia Rossi, DVM Dipl. ECVCP - Dr.ssa Giulia Mangiagalli, DVM

Bibliografia:

• Woolcock AD et al. Thrombocytosis in 715 Dogs (2011–2015). J Vet Intern Med 2017
• Neel A et al. Thrombocytosis: a retrospective study of 165 dogs Vet Clin Pathol. 2012 Jun;41(2):216-22.
• Rizzo F et al. Thrombocytosis in cats: a retrospective study of 51 cases (2000-2005). Journal of Feline Medicine and Surgery (2007) 9, 319-325
• Phipps E et al. Postoperative thrombocytosis and thromboelastographic evidence of hypercoagulability in dogs undergoing splenectomy for splenic masses J Am Vet Med Assoc 2020 Jan 1;256(1):85-92.
• Veterinary Hematology, a Diagnostic Guide and Color Atlas. First Edition Elsevier, 2012
• Stockham SL. Fundamentals of Veterinary Clinical Pathology, I ed., 2002
• https://eclinpath.com/hemostasis/disorders/platelet-numbers/

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L'amiloidosi nel cane e nel gatto

Con il termine AMILOIDOSI si intende un gruppo eterogeneo di patologie caratterizzate dalla deposizione extracellulare di fibrille di circa 10 nm di diametro in vari tessuti; esse sono formate dalla polimerizzazione di subunità proteiche con una specifica conformazione a β foglietti. Questa particolare struttura conferisce caratteristiche peculiari ottiche e tintoriali ai suoi depositi (vedi oltre) e ne determina l’insolubilità e la resistenza alla proteolisi in vivo.

Dal punto di vista ultrastrutturale, queste fibrille hanno composizione chimica variabile in quanto il peptide amiloidogenico (costituente della parte più esterna, pari al 95%) deriva dalla deposizione di una proteina differente a seconda della patologia in atto. La deposizione può avvenire per due meccanismi: per una mutazione genetica della proteina o per l'azione di una proteasi che ne deforma la struttura. Internamente, l'amiloide è invece composta da un nucleo di componente AP (amyloid P component), glicoproteina globulare ed aggregati di condroitinsolfato ed eparansolfato.

Le amiloidosi sono classificate secondo due principi: distribuzione dei depositi e proteina d’origine coinvolta.

1) DISTRIBUZIONE DEI DEPOSITI

Si tratta di una classificazione   di tipo clinico che distingue due forme: localizzata e sistemica. La forma localizzata colpisce un solo organo ed è piuttosto rara negli animali domestici. Ne sono un esempio l’amiloidosi delle isole pancreatiche del gatto (le cellule β del pancreas producono in quantità eccessiva amilina che si deposita tra di esse danneggiandole fino a causare un diabete principalmente di tipo II) e il plasmocitoma extramidollare cutaneo o gastroenterico (producono sostanza amiloide associata alle globuline).

La forma sistemica è invece la più frequente e coinvolge più organi; comprende la forma reattiva, la forma di carattere ereditario-familiare e quella associata a discrasia delle immunoglobuline. Nel cane e nel gatto la deposizione di sostanza amiloide avviene principalmente nel rene e nel fegato, ma possono anche essere coinvolti altri tessuti (cuore, milza, surreni, linfonodi, pancreas e tratto gastroenterico, sistema nervoso, vasi sanguigni). La deposizione può essere talmente grave da determinare la rottura dell’organo coinvolto.

2) BIOCHIMICA DELLA PROTEINA COINVOLTA

Esistono diversi tipi di proteine (circa 20-25) che possono determinare l’amiloidosi, ma le principali sono essenzialmente due: AA (la più comune) e AL.

La forma AA (AA amiloide) è un frammento derivante dalla degradazione della proteina di fase acuta positiva SAA (siero amiloide A) prodotta principalmente dal fegato. In caso di infezione/infiammazione cronica (+++), neoplasie e traumi, questa proteina è prodotta in quantità eccessive (può aumentare di centinaia di volte la sua concentrazione normale sierica) e viene attaccata dai macrofagi tramite gli enzimi lisosomiali nel tentativo di degradarla.  In alcuni casi quello che però si ottiene è un’alterazione parziale della proteina SAA che diventa fibrillare, non più idrosolubile e che quindi si deposita nei tessuti in forma AA; questo è ciò che avviene nelle forme reattive e di carattere ereditario – familiare.

La forma AL (AL amiloide) invece è meno comune e deriva dalle catene leggere delle Immunoglobuline prodotte da plasmacellule neoplastiche in corso di mieloma multiplo o di linfoma B secernente immunoglobuline (più raro).

Le principali forme cliniche riportate in letteratura veterinaria sono:

• amiloidosi di carattere ereditario – familiare reattiva, segnalata nei cani di razza Shar-Pei, Beagle e Fox Hound e nei gatti di razza Abissino, Siamese ed Orientale a pelo corto (forma sistemica e deposizione di AA)
• amiloidosi reattiva secondaria (forma sistemica e deposizione di AA)
• amiloidosi da discrasia delle plasmacellule (forma sistemica e deposizione di AL).

In letteratura non sono segnalate particolari predisposizioni di sesso ed età dei pazienti che possono sviluppare l’amiloidosi (nella forma di carattere ereditario-familiare può presentarsi più frequentemente in giovane età). I depositi di amiloide si riscontrano meno frequentemente nel fegato e più frequentemente nel rene, con una differenza sostanziale tra cane e gatto, ovvero nel cane è più spesso coinvolta la porzione glomerulare, mentre nel gatto quella tubulo-interstiziale. Vi sono però alcune eccezioni: nei cani di razza Shar-Pei la deposizione di sostanza amiloide è tubulo-interstiziale, mentre nei gatti di razza Abissino può essere anche glomerulare. Inoltre, nei gatti di razza Siamese ed Orientale a pelo corto la deposizione di sostanza amiloide è primariamente epatica.

La sintomatologia clinica dell’amiloidosi non è specifica ma variabile per il suo carattere prevalentemente sistemico e dipende dall'estensione del danno funzionale degli organi e dei tessuti colpiti. È bene ricordare che molto spesso il riscontro di deposizioni amiloidi locali o sistemiche (soprattutto di modica entità) è un reperto “accidentale” clinicamente non significativo riscontrato durante altre indagini diagnostiche.

Anche dal punto di vista clinico – patologico le alterazioni di laboratorio possono non essere rilevanti e/o specifiche a seconda dell’entità della deposizione, del tipo di proteina amiloide e dell’organo coinvolto.

In sintesi, i quadri clinico patologici più comuni sono:

• deposizione renale: aumento dei valori sierici di azotemia e creatinina in genere tardivi, proteinuria anche molto marcata ma solo in caso di deposizione glomerulare, possibile ipercolesterolemia (sindrome nefrosica);
• deposizione epatica: alterazioni riconducibili ad insufficienza epatica (ipoprotidemia con ipoalbuminemia, diminuzione della concentrazione sierica dell’urea, allungamento di PT, APTT, diminuzione del fibrinogeno). Generalmente non c’è aumento delle transaminasi;
• nel caso di amiloidosi di tipo AL: possibile picco monoclonale in β – γ nell’elettroforesi sieroproteica e/o proteinuria di Bence Jones nell’elettroforesi delle proteine urinarie SDS-AGE.

La misurazione della SAA sfortunatamente non offre indicazioni utili poiché non è necessariamente elevata in corso di amiloidosi ed essendo semplicemente una proteina di fase acuta positiva aumenta in modo aspecifico in corso di qualsiasi flogosi.  

DIAGNOSI

La diagnosi di amiloidosi è citologica e soprattutto istologica (gold standard). La sostanza amiloide si colora di rosa intenso (talvolta arancione) con colorazioni citologiche di tipo Romanowsky e con ematossilina – eosina nei preparati istologici ed appare come un denso materiale amorfo extracellulare, talvolta chiaramente fibrillare che si dispone tra le cellule del parenchima coinvolto. La colorazione Rosso Congo è la colorazione più comunemente usata per l'identificazione dell'amiloide in citologia ed istologia. Con questa metodica, l'amiloide si colora di arancione – rosso sotto microscopia ottica e appare come un materiale birifrangente verde mela sotto luce polarizzata. Per tipizzare le principali due forme di proteina amiloide (AA e AL) può essere utilizzato il permanganato di potassio con soluzione al 5%: l’AA amiloide si decolora e perde l’affinità con il Rosso Congo e la proprietà di birifrangenza, mentre AL amiloide mantiene le sue caratteristiche tintoriali.

Infine, l'immunoistochimica può essere utilizzata non solo per identificare i depositi di amiloide ma anche per tipizzare i componenti specifici dei depositi: solitamente si utilizzano anticorpi per le catene leggere dell’AL o per dimostrare la deposizione AA nelle forme familiari.

Dr.ssa Silvia Rossi, DVM Dipl. ECVCP – Dr.ssa Marta Attini, DVM

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