Filariosi: incontri ravvicinati, anche in Istologia
Sapevate che anche in istologia a volte si trovano filarie e microfilarie?
Come appaiono? Perché è sempre importante effettuare la tipizzazione esatta delle microfilarie anche se a volte sono un “riscontro casuale’”?
C’è filaria e filaria… scoprite più dettagli dell’approfondimento che potete visualizzare cliccando qui sotto
Dr.ssa Gaia Vichi, DVM, Dipl. ECVP
Valutazione margini istologici di escissione
Valutazione dei margini istologici di escissione
Informazioni importanti per la scelta della valutazione dei margini istologici di escissione
Scopriamo di più in utile approfondimento a cura della Dr.ssa Gaia Vichi (DVM, Dipl. ECVP):
Esame Istologico Linfonodale in gatti con MASTOCITOMA CUTANEO
L’IMPORTANZA DELL’ESAME ISTOLOGICO LINFONODALE
IN GATTI CON MASTOCITOMA CUTANEO
Dr.ssa Gaia Vichi DVM, Dipl.ECVP
Il mastocitoma cutaneo è un’entità neoplastica di riscontro frequente nella specie felina, rappresentando circa il 20% delle neoplasie a localizzazione cutanea.
Ma cosa sappiamo del coinvolgimento linfonodale da parte del mastocitoma cutaneo felino?
Aggiornamento sui fattori prognostici per il linfoma cutaneo epiteliotropo nel cane
Questa pillola di istologia è dedicata ad un approfondimento sul linfoma cutaneo epiteliotropo nel cane (classificato come linfoma a cellule T periferico).
Questa patologia neoplastica colpisce la cute, le giunzioni muco-cutanee e le mucose presentandosi in forma di lesioni di vario tipo: eritematose, ipercheratosiche, crostose, erosivo/ulcerative, con depigmentazione e, come nel caso delle lesioni sul planum nasale, anche con possibile perdita del suo normale aspetto ‘ad acciottolato’.
Nelle forme più avanzate la patologia può evolvere in forma di placche o lesioni nodulari, anche con coinvolgimento linfonodale e viscerale.
Ad ogni modo spesso la risposta alla chemioterapia è scarsa e vi è progressione della patologia, sebbene con grande variabilità nella durata del decorso clinico, con tempi di sopravvivenza che vanno da pochi giorni a 5 anni post-diagnosi, con una maggiore sopravvivenza associata, secondo lo studio di Chan, Frimberg e Moore su Veterinary Dermatology del 2018, a forme ad insorgenza solitaria e con coinvolgimento solo mucosale o a livello di giunzioni muco-cutanee.
I 3 maggiori sottotipi di linfoma cutaneo epiteliotropo nel cane sono, secondo la classificazione REAL/WHO i seguenti:
- la cosiddetta reticolosi pagetoide (con elementi linfoidi neoplastici localizzati solo a livello di epidermide ed annessi),
- la micosi fungoide (con coinvolgimento di epidermide, derma e annessi),
- la sindrome di Sézary (micosi fungoide associata a leucemia)
Oltre a questi tipi sono in realtà descritti anche rari casi di micosi fungoide senza coinvolgimento dell’epidermide, ma solo del derma e della parete dei follicoli piliferi.
Uno studio molto recente di Dettwiler et al. su Veterinary Pathology del 2023 si è riproposto, sulla base dell’analisi retrospettiva di 176 casi, di valutare i parametri clinici ed istopatologici associati con diverse risposte ai protocolli terapeutici e diverso tempo di sopravvivenza.
Concentrandoci, dato che stiamo somministrando una “pillola di istologia” sulle caratteristiche istopatologiche con significato prognostico, possiamo elencare i seguenti risultati scaturiti dal suddetto studio:
- coinvolgimento tissutale profondo: l’infiltrazione estesa del tessuto adiposo del pannicolo è associata con maggiore rischio di morte in tempi rapidi (tale parametro è associabile ad una forma clinicamente più avanzata con riscontro macroscopico di lesioni nodulari o a placca)
- dimensioni delle cellule e dei nuclei: un diametro cellulare medio maggiore a 10,0 micrometri ed un diametro nucleare medio maggiore di 8,3 micrometri sono associati ad una prognosi peggiore (con minore tempo di sopravvivenza)
- attività mitotica: un numero di mitosi maggiore o uguale a 7 per singolo HPF (pari ad un’area di 0.237 mm2) è anche essa associata ad una prognosi peggiore (con minore tempo di sopravvivenza)
- aspetto della cromatina (e del citoplasma delle cellule neoplastiche): un aspetto ammassato, irregolarmente addensato della cromatina ed un aspetto maggiormente basofilico del citoplasma delle cellule sono altri due parametri associati con un maggiore rischio di morte “istantanea”; tuttavia questi due parametri sono da valutare con maggiore cautela degli altri perché una fissazione subottimale dei campioni può alterare l’aspetto della cromatina e la basofilia del citoplasma dipende dai protocolli di colorazione del laboratorio.
Quanto ai parametri clinici analizzati riassumiamo brevemente quelli che, sulla base dello stesso studio, hanno mostrato un significato prognostico sfavorevole:
- il coinvolgimento cutaneo (non solo delle giunzioni muco-cutanee/mucosale)
- la formazione di noduli
- la formazione di lesioni crostose
Al contrario, la remissione clinica completa post-terapeutica e una forma patologica clinicamente stabile appaiono associate a tempi di sopravvivenza maggiori.
Gaia Vichi DVM Dipl.ECVP
Bibliografia:
Chan CM, Frimberger AE, Moore AS. Clinical outcome and prognosis of dogs with histopathological features consistent with epitheliotropic lymphoma: a retrospective study of 148 cases (2003-2015). Vet Dermatol. 2018;29:154–159.
Dettwiler M, Mauldin EA, Jastrebski S, Gillette D, Stefanovski D, Durham AC. Prognostic clinical and histopathological features of canine cutaneous epitheliotropic T-cell lymphoma. Veterinary Pathology. 2023;60(2):162-171.
Vimentina e Ki67 come markers molecolari per il carcinoma gastrico del cane
In questa pillola di istologia andiamo a parlare di un recente studio che ha proposto l’utilizzo di due markers di immunoistochimica (vimentina e Ki67) per un’entità patologica neoplastica specifica: il carcinoma gastrico del cane. Come andremo a vedere nella trattazione, che richiama i punti salienti dello studio stesso, sebbene i dati da esso derivanti necessitino di ulteriori studi (possibilmente prospettici e non solo retrospettivi e con un’ampia casistica) al fine di essere validati, sembrano indicare come promettenti entrambi i markers ai fini prognostici per la neoplasia oggetto di indagine.
Il carcinoma gastrico, pur non essendo tra le neoplasie canine più frequenti rappresenta un’elevata percentuale delle neoplasie maligne di questa specie a livello dello stomaco, superiore al 50% (Amorim I et al. 2016), con frequente riscontro di metastasi (soprattutto a livello linfonodale). Dal momento che fino ad uno stadio avanzato la neoplasia ha un decorso spesso paucisintomatico la diagnosi è spesso tardiva e, in caso di infiltrazione diffusa della parete gastrica o presenza di metastasi o stato gravemente debilitato dell’animale, anche con la resezione chirurgica della neoplasia, le complicazioni sono frequenti.
Mentre per il carcinoma gastrico dell’essere umano sono riconosciuti vari markers molecolari con valore prognostico non si può ad oggi affermare altrettanto per la specie canina, anche se alcuni markers (HER-3, HER-2, EGFR, and KRAS gene) sono stati investigati per il loro potenziale prognostico, la scarsità di dati non ha permesso la definitiva validazione dei risultati.
Anche la classificazione morfologica dei vari istotipi (il papillare, il tubulare, il mucinoso, il ‘signet ring cell’ e l’indifferenziato riconosciuti dalla classificazione WHO per gli animali oltre allo scarsamente coesivo e al misto riportati nella classificazione WHO per l’essere umano, ma osservati anche nel cane) ha scarso valore prognostico. La classificazione secondo Lauren (forma diffusa, forma cosiddetta ‘intestinal-type’ e forma indeterminata nel caso di una commistione delle prime due tipologie), poi adattata anche al cane, sembra avere un migliore valore prognostico. Malgrado ciò resta la necessità di trovare dei markers molecolari con un valore prognostico significativo per la specie canina.
Lo studio recente di cui trattiamo in questa pillola di istologia (Flores AR et al. 2022) ha cercato di indagare il possibile significato prognostico dell’espressione aberrante della vimentina nelle cellule del carcinoma gastrico del cane (solitamente non espressa dalle cellule epiteliali) e della sua espressione nello stroma associato alla neoplasia, nonché dell’indice proliferativo delle cellule epiteliali neoplastiche espresso mediante immunoreattività nucleare al marker Ki67.
L’espressione aberrante della vimentina da parte delle cellule epiteliali neoplastiche è stata riscontrata solo nelle tipologie meno differenziate (classificazione secondo Lauren: forma diffusa ed indeterminata e non nella forma intestinale, meglio differenziata rispetto alle altre) e la sua espressione è risultata più intensa in corrispondenza del fronte invasivo della neoplasia.
In realtà dal punto di vista statistico non sono state osservate differenze significative, nella formazione di emboli neoplastici e metastasi, tra i carcinomi gastrici con o senza espressione aberrante della vimentina da parte dell’epitelio neoplastico. In alcuni casi tale espressione è stata inoltre riscontrata a livello di emboli e metastasi, ma non nella neoplasia primaria.
Considerando un’area pari al 16% del tessuto stromale associato alla neoplasia come cut-off per il livello di espressione della vimentina nello stroma stesso si è visto che anche in questo caso un suo alto livello di espressione era associato con la forma diffusa (scarsamente differenziata). Oltre a ciò, è anche stata notata una maggiore intensità di immunomarcatora nelle cellule stromali che circondavano clusters di cellule neoplastiche con comportamento invasivo (facendo ipotizzare che il comportamento invasivo della neoplasia possa essere promosso dalle cellule stromali con marcata espressione della vimentina che circondano i clusters di cellule neoplastiche infiltranti, sebbene siano necessari altri studi per dimostrare la validità di tale ipotesi).
Quanto all’indice proliferativo (relativo alle cellule epiteliali neoplastiche) espresso mediante Ki97 questo è stato correlabile solo al livello di espressione della vimentina nello stroma associato alla neoplasia (sempre per una possibile interazione tra cellule neoplastiche epiteliali e cellule stromali, o viceversa).
Relativamente all’effettivo significato prognostico di tali parametri sono stati fatti i seguenti riscontri:
-correlazione debole tra l’espressione aberrante della vimentina nelle cellule epiteliali neoplastiche e tempo di sopravvivenza (dei cani oggetto di studio)
-debole correlazione negativa tra l’espressione della vimentina nello stroma associato alla neoplasia e tempo di sopravvivenza
-correlazione negativa moderata tra l’indice proliferativo (delle cellule epiteliali neoplastiche) espresso mediante Ki67 (con cut-off pari al 20%) e tempo di sopravvivenza
Sebbene lo studio appena citato abbia un valore abbastanza limitato (data la sua natura retrospettiva, il numero relativamente limitato di casi indagati e la parziale perdita dei dati clinici e del follow-up di alcuni casi) resta comunque il suo valore per aver proposto due markers molecolari fino ad oggi ancora non indagati per il loro significato prognostico relativo al carcinoma gastrico del cane.
Dati i risultati sembrerebbero promettenti come markers sia l’espressione della vimentina (in particolare relativamente allo stroma associato alla neoplasia) che l’indice proliferativo (delle cellule epiteliali neoplastiche) espresso mediante Ki67.
Dr.ssa Gaia Vichi DVM, Dipl.ECVP
Bibliografia:
- Amorim I, Taulescu MA, Day MJ, Catoi C, Reis CA, Carneiro F, Gärtner F. Canine Gastric Pathology: A Review. J Comp Pathol. 2016 Jan;154(1):9-37
- Flores AR, Rêma A, Mesquita JR, et al. Vimentin and Ki-67 immunolabeling in canine gastric carcinomas and their prognostic value. Veterinary Pathology. 2022;59(6):903-914.
IL REFERTO ISTOLOGICO - Parte VI: Valutazione dei margini, Colorazioni speciali, diagnosi morfologica e commento
Con questa pillola di istologia si conclude la serie dedicata alle parti del referto istologico. Andiamo ad analizzare nel dettaglio le parti conclusive del referto.
Valutazione dei margini: si tratta della valutazione della distanza minima, espressa in millimetri, tra un tessuto neoplastico ed i margini delle sezioni in esame (ottenute mediante varie possibili metodiche di trimming, che abbiamo spiegato nel dettaglio in una pillola di istologia precedente dedicata a questo specifico argomento). Si valuta inoltre, in relazione al margine profondo, anche l’eventuale interposizione di un piano fasciale.
Ovviamente la valutazione completa dei margini si esegue per lesioni neoplastiche sottoposte a biopsia escissionale o a chirurgia radicale e non per lesioni neoplastiche sottoposte a biopsie incisionali o per lesioni di natura non neoplastica, per cui è sufficiente dire se la lesione raggiunga o meno i margini delle sezioni senza la misurazione esatta della distanza da essi espressa in millimetri.
Colorazioni speciali: a volte il patologo richiede ai tecnici anche l’esecuzione di colorazioni speciali, riportandone poi il risultato nel referto stesso. Per colorazioni speciali si intendono le colorazioni istochimiche e non immunoistochimiche: ovvero ottenute con reazioni chimiche tra specifici reagenti e componenti tissutali e non con l’uso di anticorpi che vanno a legare antigeni specifici sui tessuti.
Questo tipo di colorazioni può avere diverse applicazioni:
- possono servire ad esempio a cercare nel campione in esame la presenza di alcuni agenti patogeni con particolari affinità per i reattivi stessi (Ziehl Neelsen per micobatteri, Gram per batteri Gram+ e Gram-, colorazioni argentiche per spirochete, PAS o Grocott per funghi o lieviti, mucicarminio per Criptococco)
- possono anche servire a svelare la metacromasia delle granulazioni citoplasmatiche dei mastociti (Blu di Toluidina, Giemsa)
- possono mettere in evidenza la presenza di particolari sostanze o elementi (Alcian blu per le mucine acide o glicosaminoglicani solfatati, Rosso Congo per l’amiloide con particolare birifrangenza verde mela all’osservazione con luce polarizzata, von Kossa per i sali di calcio, Orceina acida per le fibre elastiche, Rodanina per il rame etc…)
Diagnosi Morfologica: senza ombra di dubbio è la parte del referto che più interessa il clinico, anche se ricordiamo che tutte le componenti del referto concorrono alla sua completezza e al suo valore scientifico, nonché alla sua utilità, soprattutto per possibili future visite di referenza in cui occorre la documentazione più completa ed accurata possibile sulle lesioni già sottoposte ad esame istologico.
La diagnosi morfologica si compone, per le entità neoplastiche, del nome della neoplasia (che in sé spesso racchiude anche il concetto di benignità o malignità), della sua eventuale variante, del tessuto o organo in cui si localizza, oltre che del grado istologico (nel caso esista un sistema di grading riconosciuto come valido dalla comunità scientifica internazionale per quella entità neoplastica) e dell’eventuale indicazione della presenza di invasione vascolare.
Tanto per fare un esempio possiamo citare, per una neoplasia mammaria di una cagna, un Adenocarcinoma (ovvero neoplasia maligna di origine ghiandolare), mammario (tessuto colpito), tubulare (pattern della neoplasia), semplice (ovvero composto da solo epitelio), di grado III (secondo il sistema di grading che nel caso delle neoplasie mammarie canine è quello secondo Peña et al.), con numerosi emboli neoplastici in vasi linfatici peritumorali (indicazione aggiuntiva relativa alla presenza di invasione vascolare e della quantità di emboli).
Per le lesioni infiammatorie, la diagnosi morfologica si compone di un nome che indica la presenza di flogosi ed il tessuto colpito, più una serie di “descrittori” che indicano la cronicità o l’acuzie del processo patologico, la tipologia di infiltrato infiammatorio, la sua distribuzione e la sua entità.
Anche in questo caso facciamo un esempio: pannicolite (flogosi del tessuto sottocutaneo), cronica (cronicità), piogranulomatosa (con infiltrato composto da neutrofili e macrofagi epitelioidi, eventualmente anche con cellule giganti multinucleate), focale (distribuzione in un singolo focolaio), di moderata entità (indica la gravità della flogosi stessa).
Per le lesioni degenerative sarà invece riportata la tipologia di lesione, la sede colpita, la distribuzione e la gravità.
Per fare un esempio potremmo citare una amiloidosi (tipo di lesione) epatica (localizzazione), diffusa e massiva (distribuzione), di severa entità (gravità della lesione).
A volte, infine, nel caso il processo patologico abbia un’eziologia specifica, oltre alla diagnosi morfologica si indica anche l’eziologia stessa o si fa una diagnosi eziologica (indicando in soli due termini l’agente eziologico ed il tessuto colpito, ad esempio demodicosi cutanea follicolare nel caso di un’infestazione da Demodex spp. nei follicoli piliferi della cute).
Commento: è la parte conclusiva del referto ed è compilato dal patologo quando si ritiene opportuno dare ulteriori indicazioni al clinico, ad esempio scrivendo in maniera esplicita la benignità o la malignità di una neoplasia (cosa che può risultare gradita al clinico stesso per riuscire a spiegare in termini semplici la diagnosi al proprietario dell’animale) e la sua esatta origine tissutale, oppure esprimendo la possibile presenza di diagnosi differenziali per alcuni tipi di lesioni non riconducibili con assoluta certezza ad una determinata entità patologica, o ancora elencando al clinico ulteriori possibili indagini aggiuntive utili ad avere una diagnosi più esatta o completa.
In questa sezione, infatti, il patologo può indicare al clinico l’opportunità di procedere con indagini di immunoistochimica (e qui rimandiamo ad una precedente pillola di istologia in cui veniva chiarita la loro utilità) o con indagini di biologia molecolare (come la PARR per la valutazione della clonalità linfoide per sospetti linfomi o una PCR o una FISH per la ricerca di un agente eziologico specifico, sospettato, ma non immediatamente riconoscibile nelle sezioni esaminate mediante istologia).
Dr.ssa Gaia Vichi, DVM, Dipl. ECVP
IL REFERTO ISTOLOGICO - Parte V: caratteri associati a comportamento biologico maligno ed altri dettagli morfologici
Proseguendo la nostra serie di “pillole di istologia” sulle varie parti di un referto istologico ci concentriamo, con questa breve discussione, sugli ultimi paragrafi della descrizione istologica, relativi in particolare alle entità neoplastiche.
A. I caratteri associati a comportamento biologico maligno di una neoplasia possono essere diversi. Vediamone un breve elenco:
- Necrosi: vanno sempre descritti, se presenti nel contesto di un tessuto neoplastico, eventuali fenomeni di necrosi, indicandone se possibile anche la loro esatta tipologia (necrosi coagulativa, necrosi colliquativa, necrosi caseosa, cosiddetta “single cell necrosis” o necrosi di cellule neoplastiche singole disseminate nel contesto della lesione). Ovviamente se la necrosi è presente va indicata anche la sua distribuzione e soprattutto la sua estensione in relazione alle dimensioni della lesione in termini percentuali. La percentuale di necrosi sul tessuto neoplastico è infatti, per alcune entità patologiche, uno dei parametri da valutare per il grading istologico (ad esempio per i sarcomi dei tessuti molli).
- Emorragia: anche per eventuali fenomeni di tipo emorragico va descritta, nel caso siano presenti, la distribuzione e la loro estensione nel contesto della lesione.
- Invasione capsulare: a volte la distinzione di un processo neoplastico maligno rispetto alla sua controparte benigna può risultare difficoltosa, in quanto le cellule di una neoplasia maligna non necessariamente mostrano un grado elevato di anisocitosi/anisocariosi o abbondante attività mitotica. In alcuni casi un criterio distintivo di malignità può essere l’invasione di un eventuale tessuto capsulare che circonda lo stesso tessuto neoplastico (ad esempio ciò accade spesso per i carcinomi della tiroide).
- Invasione vascolare: alcune neoplasie maligne hanno un comportamento biologico non solo aggressivo ed infiltrante nei confronti dei tessuti limitrofi, ma anche con tendenza ad invadere i vasi linfatici, e talvolta ematici, formando emboli che possono poi consentire, entrando in circolo, l’impianto neoplastico in linfonodi regionali o in altri organi e tessuti a distanza. Va pertanto indicata l’eventuale presenza di emboli neoplastici intravasali, indicando il loro quantitativo (scarso: <5 foci; moderato: 5-10 foci; abbondante: >10 foci), la tipologia di vasi coinvolti (linfatici/ematici) e la loro distribuzione (intratumorale/peritumorale).
Anche la presenza di elementi neoplastici in sede subendoteliale, che tendono a protrudere nel lume vascolare senza oltrepassare l’endotelio stesso (cosiddetto “vascular impingement”, oppure esito di una ri-endotelizzazione di tessuto neoplastico dopo invasione vascolare vera e propria), merita l’attenzione del patologo in quanto impone l’attenta ricerca di ulteriori parametri tali da identificare una eventuale invasione vascolare propriamente detta (presenza di trombi aderenti ad elementi neoplastici intravasali, cellule neoplastiche che invadono sia la parete vasale che l’endotelio, cellule neoplastiche nel lume di spazi vascolari rivestiti da endotelio, cellule neoplastiche in strutture di natura vasale confermata anche con eventuale ausilio di markers immunoistochimici nei casi dubbi).
B. Vi sono poi anche dettagli morfologici aggiuntivi, talvolta anche essi importanti per il grading istologico di alcune entità neoplastiche, come la presenza e l’eventuale intensità di una flogosi concomitante al processo neoplastico (che costituisce ad esempio uno dei parametri che concorrono al sistema di grading per i sarcomi dei tessuti molli cutanei e sottocutanei del gatto recentemente proposto da Dobromylskyj et al. nel 2021), l’eventuale presenza di ulcerazione (che costituisce un parametro prognostico sfavorevole, ad esempio, per le neoplasie melanocitarie cutanee del cane), o la presenza di mineralizzazione (ad esempio per eventuali fenomeni di calcificazione distrofica nel contesto di foci di necrosi, oppure legata ad alcune entità patologiche specifiche, come ad esempio il pilomatricoma, che costituisce una neoplasia benigna di origine annessiale/follicolare, talvolta anche con possibile formazione di tessuto osseo).
Infine, se nei preparati sono presenti altre alterazioni a carico dei tessuti limitrofi alla lesione principale (che sia neoplastica o meno) il patologo descriverà anche tali aspetti morfologici, al fine di “contestualizzare” le lesioni stesse.
Concludendo, al clinico potrà sembrare che tutti i dettagli riportati dal patologo nel paragrafo descrittivo di un referto istologico siano meno importanti dei campi relativi alla diagnosi morfologica e al commento sulla lesione, ma in realtà come recita un vecchio detto “il diavolo si nasconde nei dettagli” e, soprattutto, i dettagli osservati e descritti dal patologo consentono di corroborare la sua conclusione diagnostica ed agevolano anche un eventuale confronto tra colleghi sul caso stesso, in quanto documentano, appunto nel dettaglio, tutto ciò che il patologo ha visto, come una lunga serie di “fotografie” scattate ai vari campi microscopici.
I dettagli descrittivi garantiscono anche il fatto che il patologo abbia effettivamente valutato a fondo il preparato o i preparati, non limitandosi ad una descrizione sommaria o a una diagnosi “preconfezionata” applicabile ad entità patologiche simili, della stessa natura, ma non necessariamente identiche. Non si tratta solo di una “personalizzazione” del referto, ma di una sua effettiva validazione in termini qualitativi e di corrispondenza alla realtà oggettiva dell’aspetto istologico delle singole lesioni.
Dr. Gaia Vichi, DVM, Dipl. ECVP
Bibliografia:
- Veterinary Cancer Guidelines and Protocols. Guidelines for necrosis and vascular invasion. https://vcgp.org/guidelines-and-protocols/
- Prognostic factors and proposed grading system for cutaneous and subcutaneous soft tissue sarcomas in cats, based on a retrospective study. Dobromylskyj M. et al. J Feline Med Surg. 2021; 23(2):168-174.
IL REFERTO ISTOLOGICO - Parte IV: La conta mitotica (e la sua standardizzazione)
L'attività mitotica è una componente fondamentale da valutare nell’esame istologico delle entità neoplastiche.
La sua valutazione, inoltre, oltre ad essere, per alcune entità neoplastiche, un indice prognostico indipendente, rientra assieme ad altri parametri nella maggior parte dei sistemi di grading neoplastico (grading istologico da non confondere con lo staging clinico o stadiazione, effettuata non dal patologo, ma dall’oncologo clinico che segue il caso).
Le neoplasie maligne hanno solitamente un’elevata attività mitotica (con maggiore proliferazione cellulare rispetto a neoplasie con comportamento biologico meno aggressivo).
Senza ombra di dubbio la valutazione istologica dell’attività mitotica necessita, al pari della valutazione degli altri dettagli morfologici delle entità neoplastiche, di un sistema standardizzato ed universalmente riconosciuto come valido ed applicabile ai vari sistemi di grading.
A tale scopo si utilizza solitamente la Conta Mitotica, intesa come il numero di figure mitotiche in 10 campi istologici a forte ingrandimento (detti high-power fields o hpf), ovvero ad ingrandimento 400x, applicata sia in ambito di istologia oncologica umana che veterinaria ed utilizzata anche dai sistemi di diagnostica digitale.
A tal proposito, al fine di una standardizzazione completa va specificato che l’area di osservazionecorrispondente a 10 campi istologici ad ingrandimento 400x è in realtà variabile (del 33% o più) a seconda del numero di campo (Field Number o FN) dell’oculare del microscopio utilizzato.
La comunità scientifica internazionale ha stabilito quindi la necessità della valutazione della Conta Mitotica su un’area ben precisa, pari nello specifico a 2,37 mm2, ovvero l’area di 10 HPF osservati con oculare 10x con FN 22mm (il tipo di oculare attualmente più utilizzato).
Ovviamente nel caso della microscopia digitale sono gli stessi tools informatici a permettere di determinare tale area standard con opportuni sistemi di calcolo e nel caso della microscopia ottica, senza scendere troppo in dettagli tecnici, il patologo, qualora debba usare un microscopio con un oculare con diverso FN, dispone dei fattori di conversione necessari ed andrà ad eseguire la Conta Mitotica su un numero di campi diverso a seconda delle ottiche in uso, ottenendo ad ogni modo, alla fine, un valore calcolato sull’area standard di 2,37 mm2.
Un altro criterio che necessita di standardizzazione è la scelta delle porzioni delle lesioni su cui effettuare la Conta Mitotica stessa. Tale conta andrebbe infatti effettuata nelle porzioni di tessuto neoplastico a maggiore densità cellulare, evitando aree con necrosi, emorragie, fibrosi, alterazioni artefattuali o spazi cistici.
Infine, un aspetto non banale è la definizione di ciò che va conteggiato come “figura mitotica”: vanno conteggiati gli aggregati di cromatina privi di membrana nucleare e con proiezioni periferiche di materiale nucleare (materiale cromosomiale). Anche se gli aggregati cromosomiali sono già tra loro distanti (telofase) dovrebbero essere ad ogni modo conteggiati come 1 singola mitosi. Ovviamente il patologo dovrà anche distinguere dalle mitosi, senza conteggiarle come tali, eventuali figure di apoptosi e cariopicnosi.
Tutte queste informazioni sulla standardizzazione della Conta Mitotica rientrano forse più nell’interesse dei patologi che dei clinici, ma indubbiamente possono chiarire alcuni dubbi a chi si ritroverà nei referti una Conta Mitotica valutata su un’area ben precisa di 2,37 mm2, anziché sui “cari vecchi 10 HPF”.
I valori di cut-off già pubblicati in passato per l’utilizzo della Conta Mitotica nei vari sistemi di grading si riferiscono alla valutazione su 10 HPF e a tali sistemi di grading si rimanda spesso nei commenti dei referti delle entità neoplastiche, ma senza dubbio l’area standard di 2,37 mm2 sarà sempre più spesso utilizzata in futuro anche per nuovi studi scientifici e per la stessa validazione dei sistemi di grading già in uso.
E’ perciò importante che anche i clinici familiarizzino con questo sistema di standardizzazione, per poter comprendere meglio il “linguaggio dei patologi” e la sua applicazione per quanto di loro maggiore interesse, ovvero il significato prognostico di quello che il patologo descrive, e in questo caso, conteggia.
Gaia Vichi, DVM, Dipl. ECVP
Bibliografia:
- Meuten DJ, Moore FM, George JW. Mitotic Count and the Field of View Area: Time to Standardize. Veterinary Pathology. 2016;53(1):7-9.
IL REFERTO ISTOLOGICO - Parte III: Le caratteristiche cellulari
In questa terza pillola di istologia dedicata alle parti del referto istologico continuiamo ad occuparci della sezione relativa alla descrizione istologica di una lesione neoplastica parlando, questa volta, della descrizione delle caratteristiche morfologiche cellulari e nucleari e delle “caratteristiche particolari” delle cellule neoplastiche.
I dettagli morfologici delle cellule neoplastiche sono, come è facile intuire, uno dei punti salienti per il riconoscimento della linea cellulare di origine, e di conseguenza per la diagnosi stessa, ma vediamo nel dettaglio cosa viene valutato dal patologo in questa sezione del referto istologico.
- Forma delle cellule: cuboidale, colonnare, poligonale, fusata o stellata, rotondeggiante. A seconda dei tessuti di origine, le cellule tendono ad avere forme specifiche: ad esempio gli epiteli sono composti da elementi a geometria cuboidale (a volte con aspetto maggiormente appiattito), colonnare o poligonale, mentre gli elementi cellulari dei tessuti connettivali, di origine mesenchimale, hanno forma tendenzialmente fusata o stellata e gli elementi di origine emopoietica e leucocitaria hanno aspetto solitamente rotondocellulare. Va da sé, pertanto, che la valutazione della forma delle cellule è spesso uno dei maggiori indizi sulla loro origine.
- Dimensioni celle cellule: le cellule possono essere di dimensioni variabili, solitamente da pochi micrometri a decine di micrometri e tali dimensioni vanno riportate nella descrizione morfologica, preferibilmente in senso assoluto (valore dimensionale medio o range relativo alle dimensioni minime e massime indicate appunto in micrometri).
- Bordi cellulari/citoplasmatici: è anche importante indicare il grado di demarcazione dei margini citoplasmatici, in quanto anche questo risulta differente a seconda del tessuto di origine (solitamente gli elementi epiteliali o di origine leucocitaria hanno margini citoplasmatici abbastanza ben definiti, mentre gli elementi mesenchimali hanno un aspetto scarsamente definito dei loro bordi cellulari).
- Citoplasma (quantità e dettagli): va riportato, in merito al citoplasma, il suo quantitativo (scarso, moderato, abbondante) in rapporto alle dimensioni cellulari o indicato in relazione alle dimensioni del nucleo, mediante il rapporto dimensionale Nucleo/Citoplasma. Del citoplasma stesso si descrivono poi gli aspetti morfologici, come l’affinità tintoriale (più o meno eosinofilo o a volte lievemente basofilo), gli eventuali aspetti di granulosità, rarefazione o vacuolizzazione (indicando in tal caso anche se i vacuoli hanno bordi netti o meno, le loro dimensioni e l’aspetto del loro contenuto). Nel caso si osservino contenuti citoplasmatici particolari va descritta la loro tipologia ed il loro colore e la loro affinità tintoriale a differenti colorazioni speciali. Facciamo alcuni esempi di contenuti citoplasmatici di varia natura:
- granulazioni assai finemente granulari-pulverulente e di colore brunastro sono compatibili con pigmento melaninico nelle cellule di origine melanocitica, mentre se lo stesso pigmento risulta fagocitato da elementi macrofagici detti melanofagi può assumere l’aspetto di granulazioni di dimensioni maggiori, grossolane-irregolari;
- fini granulazioni basofiliche con aspetti di metacromasia a colorazioni speciali come il Blu di Toluidina o il Giemsa sono tipiche dei mastociti;
- fini granulazioni citoplasmatiche eosinofiliche e con positività citoplasmatica alla colorazione PAS sono osservabili nel cosiddetto granular cell tumor;
- in alcuni carcinomi le cellule possono avere un aspetto cosiddetto ‘ad anello con castone’, ovvero con nucleo spostato alla periferia cellulare, sospinto da un vacuolo, talvolta contenente materiale mucinoso positivo alla colorazione PAS;
- nel caso di fibromi del coniglio indotti dal Rabbit fibroma virus (o Shope fibroma virus) si riscontra frequentemente la presenza di voluminosi inclusi virali citoplasmatici eosinofilici (da Poxvirus) nelle cellule fibromatose proliferate e nei cheratinociti dell’epidermide di rivestimento.
- Dettagli nucleari:
- numero dei nuclei: i nuclei possono essere singoli, o talvolta doppi, tripli o multipli
- posizione nella cellula: i nuclei possono trovarsi in posizione centrale o paracentrale o ad un polo cellulare (negli epiteli ad esempio in posizione basale o apicale in relazione alla disposizione cellulare rispetto alla membrana basale dell’epitelio), o ancora in posizione periferica o fortemente periferica (come negli osteoblasti neoplastici dell’osteosarcoma in cui il nucleo può anche avere un aspetto cosiddetto ‘punched out’, ovvero quasi ‘spinto fuori’ rispetto alla cellula stessa, in realtà ad ogni modo contenuto nella membrana cellulare) e se doppi o multipli in posizione casuale all’interno del citoplasma o con disposizioni peculiari (come nel caso di nuclei eccentrici e simmetrici nelle cosiddette ‘cellule a testa di insetto’ o di nuclei multipli e periferici, disposti in semicerchio o a cerchio nelle ‘cellule a corona’, entrambe tipologie cellulari riscontrabili ad esempio nei sarcomi dei tessuti molli derivati dalle guaine perivascolari)
- dimensioni dei nuclei: si indica il diametro nucleare medio o il range dimensionale se tale valore non è costante in tutta la popolazione cellulare, espresso in termini di micrometri o come grandezza dei nuclei in rapporto alle dimensioni di un eritrocita, come spesso si fa ad esempio per i linfomi
- forma dei nuclei: la forma del nucleo può essere rotondeggiante, ovoidale, allungata, a volte con estremità arrotondate ed aspetto ‘a sigaro’ (come nelle neoplasie del tessuto muscolare liscio), o con profilo indentato o a volte con forma e profilo irregolare (aspetto pleomorfo)
- trama cromatinica: la trama cromatinica può essere reticolata, irregolarmente e grossolanamente addensata, a volte con aspetto marginato (come può avvenire ad esempio nella linea plasmacellulare)
- numero, grandezza, aspetto e distribuzione dei nucleoli
Oltre a tali dettagli morfologici cellulari vengono anche riportate, in un paragrafo aggiuntivo, le “caratteristiche particolari” delle cellule neoplastiche quali l’eventuale presenza di cellule giganti multinucleate (osservabili in alcune tipologie neoplastiche come il cosiddetto sarcoma pleomorfo indifferenziato o undifferentiated pleomorphic sarcoma: UPS, un tempo chiamato, appunto, tumore a cellule giganti dei tessuti molli), eventuali aspetti di cheratinizzazione, secrezione o produzione di sostanze da parte delle cellule neoplastiche, invaginamenti del citoplasma etc…
Vengono riportati, infine, in coda al paragrafo relativo alla descrizione delle caratteristiche cellulari e nucleari, il grado di anisocitosi (variazione di aspetto e dimensioni delle cellule neoplastiche) e di anisocariosi (variazione di aspetto e dimensioni dei loro nuclei). Sia l’anisocitosi che l’anisocariosi, se di grado elevato, sono generalmente correlabili ad una diminuzione o alla perdita della differenziazione cellulare e quindi associate ad un comportamento biologico più maligno della neoplasia stessa.
Dr.ssa Gaia Vichi, DVM, Dipl.ECVP
IL REFERTO ISTOLOGICO - Parte II: Pattern cellulari e descrizione dello stroma
Proseguendo la serie delle “pillole” dedicate alle parti strutturali del referto istologico passiamo ad altre componenti della descrizione microscopica che seguono la cosiddetta “subgross description”, iniziando dal concetto di pattern o disposizione spaziale delle cellule che compongono una lesione neoplastica e dalla descrizione della sua componente stromale.
Il pattern fornisce indicazioni utili relativamente ai rapporti spaziali tra le cellule neoplastiche (ad esempio legate alla presenza/assenza di coesività cellulare) e tra le cellule e le componenti tissutali extracellulari (che, come vedremo più avanti, concorrono a formare il cosiddetto stroma neoplastico).
Mettiamo in evidenza, inoltre, il fatto che le neoplasie mesenchimali vengano talvolta poste in diagnosi differenziale con forme di proliferazione cellulare di tipo reattivo (fibroplasia reattiva, reazioni cicatriziali…). Per questo motivo risulta utile, ai fini diagnostici, la considerazione che nelle forme reattive è spesso apprezzabile una differente “organizzazione zonale” con un gradiente maturativo. Nei casi di fibroplasia reattiva focale, ad esempio, i fibroblasti in attività proliferativa tendono a circondare una zona centrale ipocellulare.
Vediamo ora, sulla base delle diverse linee cellulari di origine delle neoplasie, quali sono le tipologie di pattern più frequentemente riscontrabili a livello istologico:
- Neoplasie epiteliali (caratterizzate generalmente da elevata coesività tra gli elementi cellulari)
- nidi, lobuli, tappeti solidi, pacchetti, trabecole e cordoni
- se con differenziazione ghiandolare anche strutture tubulari, acinari, papillari, follicolari
- Neoplasie mesenchimali (a cellule fusate, con coesività solitamente da moderata a scarsa):
- fasci o fascicoli, setti, organizzati in maniera fascicolata parallela o intrecciata, a spina di pesce, con distribuzione radiale, ‘ad impronta’, con andamento vorticoso
- ad organizzazione perivascolare (ad esempio con interposizione di piccoli vasi ramificati “a corna di cervo” o ad aspetto “placentoide”, oppure ad aspetto capillare o cavernoso, o fissuriformi, dissecanti)
- ad organizzazione perineurale (ad esempio con allineamento dei nuclei “a palizzata” in aree densamente cellulari cosiddette di tipo Antoni A, oppure in aree a tessitura lassa di tipo Antoni B, con formazione di palizzate tra loro separate da aree anucleari dette corpi di Verocay, o ancora con andamento vorticoso o con formazione di strutture che richiamano piccole radici nervose)
- con altri pattern come quello alveolare, con aderenza di elementi neoplastici periferici a setti fibrosi e perdita di coesività in aree centrali simili a spazi alveolari, come in alcune forme di rabdomiosarcoma
- Neoplasie rotondocellulari (formate da cellule “discrete” ovvero senza coesività cellulare):
- foglietti o filiere-cordoni privi di coesività cellulare
Assieme al pattern cellulare si valuta anche la componente stromale della neoplasia, ovvero il tessuto connettivale interposto agli elementi neoplastici stessi e/o alle aree di proliferazione neoplastica o a loro sostegno. Lo stroma può essere semplicemente un tessuto collagenico preesistente, composto da esili fasci di materiale extracellulare ad aspetto fibrillare eosinofilo (fasci di collagene appunto) con interposizione di un quantitativo variabile di elementi cellulari ad aspetto fibrocitico, oppure può avere aspetti peculiari, ad esempio di ialinizzazione o con accumulo di matrice extracellulare ad aspetto lasso e debolmente bluastro riferibile a matrice mixoide, oppure può essere di tipo fibrovascolare e a tessitura lassa, con presenza di piccoli vasi ematici interposti.
Talvolta, infine, si osserva anche la deposizione, tra gli elementi neoplastici, di sostanze particolari e rinonoscibili sulla base delle loro caratteristiche alla colorazione di routine con ematossilina-eosina e con l’ausilio di colorazioni speciali istochimiche (ad esempio colorazione Rosso Congo ed osservazione a luce polarizzata per l’amiloide, colorazione Alcian blu per le mucine acide etc…), oppure la deposizione di matrice osteoide, cemento, dentina.
Sia il pattern o distribuzione degli elementi cellulari, sia le caratteristiche dello stroma, sono tessere fondamentali per comporre il “puzzle” morfologico che guida il patologo alla diagnosi ed in quanto tali sono componenti chiave del referto istologico stesso.
Nelle prossime “pillole di istologia” vedremo insieme, una ad una, le restanti tessere del “puzzle diagnostico” spiegandone di volta in volta l’importanza.
Dr.ssa Gaia Vichi – DVM, Dipl.ECVP