Esame del liquido sinoviale nel cane e nel gatto

Il liquido sinoviale è un liquido ad azione protettiva, lubrificante e nutritiva contenuto all’interno delle cavità articolari e prodotto dai sinoviociti, particolari cellule connettivali della membrana sinoviale. E’ composto principalmente da una parte liquida che deriva dall’ultrafiltrazione del plasma sanguigno in cui sono presenti diverse sostanze quali acido ialuronico, glicosaminoglicani, proteine, glucosio e ioni. Il liquido sinoviale in condizioni fisiologiche si presenta come un liquido incolore, sublimpido e viscoso (caratteristica dovuta proprio alla presenza dell’acido ialuronico) ed è generalmente presente in piccole quantità all’interno delle articolazioni (possono essere aspirati in un’articolazione in un cane sano fino ad un massimo di 1 ml e 0,25 ml in un cane di piccola taglia o in un gatto). Variazioni di quantità, viscosità ed aspetto macroscopico del liquido articolare possono indicare una patologia primaria limitata ad una o più articolazioni o una manifestazione di malattia sistemica. Pertanto la raccolta e l’analisi del liquido articolare forniscono informazioni preziose per la diagnosi, la prognosi ed il trattamento di patologie primarie o secondarie a carico dell’articolazione coinvolta.

RACCOLTA DEL CAMPIONE

Una volta effettuato un ago aspirato del liquido articolare (riguardo alle vie d’accesso e tecniche di prelievo delle articolazioni più comunemente campionate si rimanda alla letteratura), il campione va strisciato tal quale direttamente sul vetrino (stessa tecnica di allestimento degli strisci ematici) avendo cura di asciugare molto rapidamente i vetrini, possibilmente utilizzando un phon: la rapida asciugatura è fondamentale per ottenere un buon allestimento del campione. A causa infatti dell’elevata viscosità, il liquido articolare si asciuga lentamente, provocando la coartazione delle cellule presenti rendendole scarsamente valutabili. Nel caso si raccolga una quantità sufficiente di liquido sinoviale, questo deve essere posto in una provetta contenente anticoagulante K3EDTA. Su questo campione sarà possibile effettuare la conta delle cellule nucleate totali e, se refrigerato, in provetta con K3EDTA la morfologia cellulare si conserva per circa 24 ore. Se si sospetta una possibile patogenesi settica, parte del campione deve essere lasciato in siringa o in caso di trasporto prolungato posto in idoneo terreno di trasporto. E’ molto importante che sul modulo di accompagnamento venga segnalato da chi ha effettuato il prelievo l’eventuale rischio (o certezza) di contaminazione ematica iatrogena: in questo caso il campione presenta striature di sangue oppure appare limpido all’inizio dell’aspirazione e diventa rossastro solo successivamente.

ANALISI DEL LIQUIDO SINOVIALE

Gli esami di laboratorio eseguibili sul campione dipendono principalmente dal volume di liquido raccolto e possono essere così schematicamente suddivisi:

  • Aspetto macroscopico del liquido sinoviale: volume, colore e torbidità, viscosità. Viene inoltre valutato il tixotropismo, ovvero la capacità di un fluido colloidale di variare la propria viscosità se sottoposto a sollecitazioni (basta agitare la provetta con K3EDTA);
  • Conta totale delle cellule nucleate: può essere manuale (con emocitometro) o automatizzata. Nel nostro laboratorio la conta cellulare viene effettuata con il citometro a flusso Sysmex dopo trattamento con Ialuronidasi per diminuirne la viscosità;
  • Esame citologico;
  • Eventuali esami aggiuntivi (es. esame colturale, PCR…) per l’identificazione di agenti patogeni.

LIQUIDO SINOVIALE NORMALE

Il liquido sinoviale normale è incolore/giallo chiaro, viscoso e di bassa cellularità. In caso di contaminazione ematica durante il prelievo può assumere colorazione rosata (un liquido sinoviale normalmente contiene pochissimi eritrociti, circa 1000/µL). La conta delle cellule nucleate varia da specie a specie ed a seconda dell’articolazione coinvolta, ma generalmente è inferiore a 1000/µL (nel cane viene considerato patologico un liquido sinoviale con cellule nucleate >3000/µL). Le cellule sono costituite per circa il 50-90% da cellule mononucleate (monociti, macrofagi e cellule di rivestimento sinoviale ma citologicamente non è possibile distinguerne l’origine), <20% di piccoli linfociti e <10% di granulociti neutrofili non degenerati. A causa dell’elevata viscosità, le cellule si dispongono allineate “in fila indiana” (nel caso di campioni di scarso volume ciò può però non verificarsi anche se la viscosità è normale). Sul fondo si osserva moderato/abbondante materiale proteinaceo granulare rosato. La concentrazione proteica solitamente è <2,5 g/dl, ma non vi sono molti studi in letteratura riguardo i valori di riferimento in articolazioni normali (Figura 1).

LIQUIDO SINOVIALE PATOLOGICO

In condizioni patologiche, si osservano generalmente un’alterazione del colore, un aumento di volume e di torbidità ed una minore viscosità del liquido sinoviale. La conta cellulare è spesso aumentata così come la concentrazione proteica ma talvolta possono non esserci alterazioni rilevanti di questi parametri. Il quadro citologico del liquido sinoviale è in genere aspecifico, fatta eccezione nei casi in cui si osservano agenti eziologici (amastigoti di Leishmania o morule di Anaplasma ad esempio) o quando è possibile osservare le LE cells, la cui identificazione in un contesto clinico e clinico patologico compatibili e unitamente ad altri criteri diagnostici supporta la diagnosi di Lupus Eritematoso Sistemico (Melendez Lazo et al 2013).

Pertanto, un liquido sinoviale patologico viene solitamente classificato in 3 principali categorie poco specifiche:

  • EMARTRO ACUTO
  • ARTROPATIA DEGENERATIVA (NON INFIAMMATORIA)
  • ARTROPATIA INFIAMMATORIA infettiva e non infettiva

Non tutti i liquidi rientrano perfettamente in questa classificazione e spesso (soprattutto nel caso di patologie croniche) i pattern possono essere misti e poco chiari. Per esempio, l’emartro stimola già in poche ore una risposta infiammatoria importante e può evolvere in un’artropatia degenerativa cronica se non adeguatamente trattato.

1) EMARTRO ACUTO

Le principali cause di emartro acuto sono le coagulopatie (specialmente da carenza di fattori della coagulazione come nell’emofilia A) e i gravi traumi acuti. Il liquido raccolto è di colore rossastro e la torbidità è aumentata in maniera direttamente proporzionale all’entità dell’emorragia presente, mentre la viscosità è inversamente proporzionale. La concentrazione proteica sarà invece maggiore così come la conta cellulare: le cellule nucleate presenti saranno leucociti di derivazione ematica. In presenza di un liquido di colore rossastro, la prima cosa da fare è quella di escludere una possibile contaminazione ematica durante il prelievo. Macroscopicamente il clinico può notare se il liquido raccolto è ematico già all’inizio dell’artrocentesi o se lo diventa in un secondo momento (segno di emorragia iatrogena). Citologicamente in un emartro non si osservano piastrine e sono ben evidenti reperti di eritrofagocitosi recente e non recente con macrofagi attivati contenenti eritrociti, emosiderina e più raramente ematoidina; in caso di emorragia iperacuta questi reperti possono non essere ancora presenti. Nel caso in cui la contaminazione ematica sia iatrogena (Figura 2) non si osserva eritrofagocitosi ed è possibile, anche se non sempre, osservare piastrine. Poiché anche in caso di contaminazione ematica iatrogena è possibile che l’eritrofagocitosi avvenga in vitro nelle ore successive al prelievo, si raccomanda di allestire subito gli strisci.

2) ARTROPATIA DEGENERATIVA (NON INFIAMMATORIA)

Un’artropatia degenerativa può essere dovuta a traumi (per lo più cronici) o a malattie degenerative acquisite o congenite delle articolazioni. Il liquido articolare spesso è di colore e torbidità normali e viscosità leggermente diminuita ma si osserva un aumento di volume (idroartrosi) ed un aumento della concentrazione proteica (generalmente <4 g/dl). Per quanto riguarda la conta cellulare, essa può essere normale o lievemente aumentata (solitamente comunque <5000 cellule/µL) con una marcata predominanza di voluminose cellule mononucleate attivate (macrofagi e sinoviociti) vacuolizzate, eventualmente in fagocitosi di detriti cellulari, talora bi/trinucleate, talvolta tendenti a una lassa coesività (Figura 3). I granulociti neutrofili solo raramente possono essere in percentuale lievemente maggiore rispetto alla normalità. In caso di danni gravi alla cartilagine articolare si possono osservare assai raramente osteoclasti e condrociti suggestivi di danno o erosione della cartilagine con esposizione dell’osso subcondrale.

Le neoplasie articolari primarie o metastatiche sono rare e assai raramente esfoliano cellule all’interno del liquido sinoviale (si tratta soprattutto di sarcomi), pertanto la presenza di cellule neoplastiche nel versamento articolare è un’evenienza piuttosto infrequente.

3) ARTROPATIA INFIAMMATORIA

Le cause di artropatia infiammatoria sono numerose e possono essere schematicamente suddivise in due gruppi: infettive e non infettive. In entrambi i casi si osserva un aumento di volume del liquido sinoviale e una diminuzione della viscosità direttamente proporzionale all’entità della flogosi. Il liquido articolare appare torbido, eventualmente rosato o brunastro (in presenza di emorragia). La conta cellulare e la concentrazione proteica sono solitamente aumentate in modo marcato (>5000 cellule/µL e >3 g/dL) con una marcata predominanza di granulociti neutrofili (>10%) ed un modico aumento di cellule mononucleate.

a) Artrite Infettiva

Le artriti infettive sono piuttosto comuni in cavalli, camelidi e bovini e più rare nel cane e nel gatto; in queste ultime due specie quando si sviluppano sono più frequentemente di origine batterica. Assai più rare sono le artriti protozoarie, virali o fungine.

In corso di flogosi batterica è più comune osservare granulociti neutrofili ben conservati e non degenerati, così come osservare fagocitosi batterica è un evento infrequente (circa 50% dei casi di artrite batterica) (Figura 4); la mancanza di questi aspetti diagnostici rende complessa la possibilità di differenziare flogosi neutrofiliche settiche da artriti immunomediate, anch’esse caratterizzate dalla presenza di una popolazione prevalente – unica di granulociti neutrofili ben conservati.

Batteri: i batteri solitamente causano una monoartrite come complicanza di ferite penetranti o interventi chirurgici, anche se il coinvolgimento di più articolazioni può verificarsi nel caso di diffusione ematogena, in corso di patologie ombelicali o endocarditi batteriche ad esempio. I microrganismi più comunemente coinvolti sono: Pasteurella, Salmonella, Corynebacterium, E. Coli, Stafilococchi, Streptococchi e Mycoplasma. In caso di sospetta artrite batterica deve essere richiesto un esame colturale, in genere soltanto per batteri aerobi. Il liquido sinoviale dell’articolazione coinvolta può essere conservato nella siringa se il campione può arrivare al laboratorio entro poche ore, oppure deve essere raccolto in idoneo terreno di trasporto. Sfortunatamente la sensibilità dell’esame colturale per questo tipo di campione è piuttosto bassa e frequentemente si ottengono falsi negativi (in alcuni lavori nel cane nel 20-50% dei casi). Alcuni Autori hanno suggerito di utilizzare tecniche di arricchimento per aumentare la possibilità di isolare i batteri nel liquido sinoviale, ma mentre in alcuni articoli è stata dimostrata una sensibilità superiore di questa tecnica, in altri questa non si è rivelata migliore delle classiche tecniche di semina. Le ipotesi suggerite per spiegare la scarsa sensibilità nell’isolare batteri in corso di artrite settica sono: terapie antibiotiche in atto, basso numero di batteri, elevata presenza di neutrofili nel campione (Scharf et al 2015; Montgomery et al 1989).

Malattie da vettore: molto raramente è stata riportata la presenza di morule di Anaplasma phagocytophilum nei granulociti neutrofili (carica molto bassa, di solito <5% delle cellule). Anche Borrelia Burgdorferi (Malattia di Lyme) può causare mono – poliartriti di natura migrante (per infezione articolare diretta o deposizione di immuno – complessi). Nel cane sono state anche associate poliartriti a infezioni da Ehrlichia, sebbene in un recente studio in soggetti infettati sperimentalmente con Ehrlichia canis non sono state rilevate alterazioni citologiche del liquido sinoviale riferibili ad artrite. Pertanto, un’infezione da Ehrlichia canis dovrebbe essere considerata una causa piuttosto rara di artrite nei cani (Theodoru K et al., 2015). In cani affetti da Leishmaniosi  possono infine essere riscontrati amastigoti di Leishmania all’interno dei macrofagi nel liquido articolare.

Tutti i cani con poliartrite che soggiornano o hanno soggiornato in aree endemiche andrebbero testati per Anaplasma p., Ehrlichia c. (sebbene non sia certo il suo ruolo causale in corso di poliartrite), Borrelia b. e Leishmania. Poiché è possibile che i cani con poliartrite da Leishmania abbiano solo la forma localizzata e non quella sistemica, ricordiamo che è evento abbastanza frequente (57% dei casi) che tali pazienti abbiano titoli anticorpali negativi; l’unico modo per attribuire a Leishmania la poliartrite è quindi osservare gli amastigoti nell’esame citologico oppure effettuarne ricerca in PCR sul liquido sinoviale (possibili falsi negativi) (Sbrana S et al., 2014).

Virus: il Calicivirus nei gattini di età compresa tra 6 e 12 settimane può produrre un’artrite costituita da liquido limpido con un moderato aumento del numero di macrofagi. Il virus della leucemia felina (FeLV) può indurre una poliartrite erosiva.

Funghi: le artriti micotiche sono estremamente rare sia nel cane che nel gatto e possono svilupparti sia per estensione di una osteomielite sia per via ematogena.

b) Artrite non infettiva

La causa più comune di artrite infiammatoria non infettiva nel cane è quella immunomediata, mentre nella specie felina sono assai più comuni le forme infettive e molto rare quelle immunomediate. Dal punto di vista clinico e clinico – patologico si tratta di un gruppo eterogeneo di patologie che generalmente coinvolgono più articolazioni e determinano zoppie migranti.

Cane: In uno studio su 39 cani con poliartrite immunomediata (Clements DN et al., 2004), la conta delle cellule nucleate variava da 3700 a 170000/µl, con il 20-98% di granulociti neutrofili. Le cause includono Lupus Eritematoso Sistemico (LES), artrite reumatoide, poliartrite erosiva, vasculite (es. Febbre dello Sharpei), poliartrite giovanile degli Akita Inu. Alcune di queste poliartropatie sono associate a neoplasie sottostanti o patologie gastrointestinali, reazioni da farmaci (es. i farmaci a base di zolfo possono provocare una poliartrite da ipersensibilità di tipo ritardato in alcune razze predisposte come i Dobermann). Il test degli anticorpi antinucleari ed il test del fattore reumatoide possono essere utili per diagnosticare una forma immunomediata.

Gatto: Si distinguono principalmente due forme di poliartrite di origine immunomediata: erosiva e non erosiva. La forma erosiva si verifica esclusivamente nei gatti maschi interi o castrati e sono state descritte due forme cliniche dell’affezione: il tipo proliferativo periostale, che presenta esordio e decorso acuto e il tipo deformante con esordio insidioso e decorso progressivo. La poliartrite cronica progressiva può essere associata al Virus della Leucemia Felina (FeLV) o all’infezione sostenuta dal virus sinciziale felino. Le cause della poliartrite non erosiva (che generalmente colpisce le articolazioni distali) possono essere idiopatiche o secondarie a LES, farmaci (trimetoprim – sulfonamidici), malattie infiammatorie (ad es. patologie gastrointestinali) e neoplasie.

Le alterazioni del liquido sinoviale in tutte queste patologie sono abbastanza sovrapponibili ed indistinguibili tra loro; citologicamente si osserva sempre un aumento dei granulociti neutrofili non degenerati che prevalgono nettamente (Figura 5) e talvolta un aumento del numero di cellule mononucleari. L’unica artropatia infiammatoria non infettiva che può essere distinta citologicamente è quella da Lupus Eritematoso Sistemico (LES): raramente in alcuni cani affetti da questa patologia possono essere presenti nel liquido sinoviale le cellule LE (granulociti neutrofili che contengono un residuo di acido nucleico di grosse dimensioni e di colore viola omogeneo che sposta il nucleo dei neutrofili a lato delle cellule) (Melendez Lazo et al 2013). Sfortunatamente mentre la presenza di queste cellule consente di diagnosticare il LES, non trovarle non consente di escluderlo (bassa sensibilità). I ragociti sono granulociti neutrofili che contengono numerosi granuli violacei la cui composizione è di origine dubbia (si ipotizza che le inclusioni possano derivare da detriti nucleari o deposizione di immuno-complessi e istoni o particelle di DNA); tali cellule possono essere osservate in corso sia di LES che di altre patologie immunomediate (Figura 6 e Figura 7).

 

Dr.ssa Silvia Rossi, DVM Dip. ECVCP – Dr.ssa Marta Attini, DVM

 

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