Formazione

Come abbiamo visto nella “pillola” precedente, è di grande importanza essere a conoscenza delle differenze degli intervalli di riferimento che esistono tra cuccioli – gattini e adulti.  Le cause di queste differenze sono da ricercarsi nel passaggio dalla vita fetale alla vita extrauterina, nell’alimentazione (colostro, latte), nell’immaturità di alcuni processi metabolici e nell’azione di alcuni ormoni, come l’ormone della crescita (GH) e il paratormone. I lavori pubblicati in letteratura che hanno determinato gli intervalli di riferimento dei comuni parametri biochimici nei cuccioli e nei gattini sono pochi e in alcuni casi riportano risultati discordanti e i laboratori in genere non forniscono intervalli di riferimento diversificati per fasce di età. Per questo è utile conoscere la patogenesi delle “alterazioni” clinico patologiche presenti nei giovanissimi, di modo da interpretare correttamente i risultati che sembrano patologici utilizzando gli intervalli di riferimento dell’adulto.

Alla nascita, la maturazione del fegato è incompleta, comportando capacità limitate nella gluconeogenesi, nello stoccaggio del glicogeno e nei processi di detossificazione (ciclo dell’urea).

Glucosio: i cuccioli e i gattini hanno una capacità limitata nella regolazione della glicemia fino ai 4 mesi di età a causa di una relativa insensibilità all’insulina e di una ridotta capacità stoccare il glicogeno e di attingere ad altre fonti di energia, come tessuto adiposo e amminoacidi. Valutando gli intervalli di riferimento specifici però non si evidenziano differenze statisticamente significative con gli adulti probabilmente perché i soggetti inclusi negli studi non erano mai a digiuno di 12 ore, in quanto avrebbero rischiato di diventare ipoglicemici. Altri analiti che risultano difficilmente confrontabili con i valori dell’adulto per la stessa ragione (mancato digiuno) sono gli acidi biliari che hanno concentrazioni simili agli adulti. Ancora il mancato digiuno è la più probabile spiegazione per i valori di trigliceridi e colesterolo, che risultano più alti rispetto agli adulti (lipemia post-prandiale). Nei primi 3 giorni di vita può essere riscontrata comunemente nei cuccioli una ipocolesterolemia.

Bilirubina: sia nei cuccioli che nei gattini è possibile osservare un aumento della bilirubinemia nei primi giorni, fino a 1 settimana di vita (nei gattini). Così come accade nel neonato si è ipotizzata come causa la ridotta capacità di un fegato immaturo di gestire la “voluminosa” emocateresi secondaria alla policitemia relativa presente al momento del parto associata all’emivita più corta degli eritrociti fetali.

ALP: i valori di fosfatasi alcalina risultano essere più elevati rispetto agli adulti sia per l’assunzione del colostro (a partire da 24 ore per 2-3 giorni) sia come risultato dell’aumentata attività osteoblastica (isoenzima osseo, B-ALP); valori elevati si osservano comunemente oltre le 8 settimane di vita fino a una completa normalizzazione intorno a 1-2 anni (Von Dehn, 2014). Nella specie canina, in seguito all’assunzione del colostro, si osserva un notevole aumento di ALP (fino a 30 volte il limite superiore, Center et al., 1991): non è del tutto chiaro se perché il colostro ne contiene grandi quantità o se la sua assunzione stimola la sintesi di questo enzima. In ogni caso, la misurazione di ALP può essere utilizzata come marker per valutare un’ottimale assunzione del colostro nei cuccioli. Altro analita che può essere utilizzato per questo scopo è la GGT, contenuta in elevate quantità nel colostro, che può raggiungere concentrazioni fino a 100 volte il limite superiore nei primi 2-3 giorni di vita (Center et al., 1991). Invece, per quanto riguarda la specie felina, solamente la ALP raggiunge valori significativamente elevati in seguito all’assunzione del colostro (Crawford et al., 2006).

Albumine – proteine totali – globuline: in entrambe le specie, i valori di albumina e proteine totali sono più bassi rispetto agli adulti fino alle 4 settimane a causa della parziale capacità di sintesi delle albumine da parte del fegato. Invece l’aumento delle globuline è progressivo, riflettendo una graduale maturità del sistema immunitario in risposta alla stimolazione antigenica, acquisita con la crescita.

ALT- amilasi – lipasi – AST, solo nel cane: nella specie canina, non si evidenziano differenze significative con gli adulti, mentre nel gatto questi enzimi risultano essere più bassi fino alle 8 settimane.

AST- CK – LDH: nel gattino, i valori di questi enzimi (nel cucciolo solo la CK) risultano essere molto elevati 24 ore dopo il parto, ipotizzando un danno muscolare al momento del travaglio per le contrazioni uterine. I valori di CK (e LDH nel gattino) scendono progressivamente, persistendo elevate fino alle 8 settimane.

Di seguito, gli intervalli di riferimento per cuccioli e gattini riportati in Letteratura.

Intervalli di riferimento dei gattini dalla nascita fino ai 56 giorni. Da: Levey et al. Effect of age on reference intervals of serum biochemical values in kittens. JAVMA, Vol 228, No. 7, April 1, 2006. NB: gli intervalli di riferimento riportati tra parentesi sono relativi a gattini che non hanno ricevuto il colostro.

Intervalli di riferimento dei cuccioli dalla nascita fino alle 8 settimane. Da: Rosset at al. Age-related changes in biochemical and hematologic variables in Borzoi and Beagle puppies from birth to 8 weeks. Vet Clin Pathol 41/2; 272–282. 2012

Intervalli di riferimento dei cuccioli dai 16 ai 60 giorni. Da: Rørtveit et al. Age-related changes in hematologic and serum biochemical variables in dogs aged 16–60 days. Vet Clin Pathol 44/1; 47–57. 2015

Nella prossima “pillola”, affronteremo i parametri biochimici relativi al metabolismo del calcio- fosforo, elettroliti e all’apparato urinario.

Dr.ssa Giulia Mangiagalli, DVM – Dr.ssa Silvia Rossi, DVM dipl. ECVCP

Bibliografia

• Center et al. Effect of colostrum ingestion on gamma-glutamyltransferase and alkaline phosphatase activities in neonatal pups. Am J Vet Res. 1991 Mar;52(3):499-504.
• Crawford et al. Evaluation of surrogate markers for passive transfer of immunity in kittens. JAVMA, Vol 228, No. 7, April 1, 2006
• Levey et al. Effect of age on reference intervals of serum biochemical values in kittens. JAVMA, Vol 228, No. 7, April 1, 2006
• Rosset at al. Age-related changes in biochemical and hematologic variables in Borzoi and Beagle puppies from birth to 8 weeks. Vet Clin Pathol 41/2; 272–282. 2012
• Rørtveit et al. Age-related changes in hematologic and serum biochemical variables in dogs aged 16–60 days. Vet Clin Pathol 44/1; 47–57. 2015
• Von Dehn. Pediatric Clinical Pathology. Vet Clin Small Anim 44; 205–219. 2014

Cosa sono i segni di tossicità che vengono riportati talvolta nei referti degli esami emocromocitometrici e quale significato hanno?

Si tratta di alterazioni strutturali che si sviluppano a livello midollare prima che i neutrofili vengano rilasciati in circolo (Gosset et al, 1985) in conseguenza di difetti maturativi secondari a granulopoiesi accelerata. In risposta a una maggior richiesta da parte dell’organismo (in presenza di flogosi, rilascio di citochine infiammatorie e granulochine) aumenta infatti la produzione dei granulociti e si riduce il loro tempo di maturazione; quando questa richiesta è particolarmente importante (flogosi acuta e grave) compare nei granulociti neutrofili la “tossicità” che noi possiamo osservare al microscopio.

Queste alterazioni possono essere osservate sia nei granulociti neutrofili maturi (segmentati) che nelle forme più immature (bandati), in corso di neutrofilia, neutropenia o in assenza di alterazioni numeriche e possono essere associate o meno a left shift.

I segni di tossicità che si possono osservare a livello di striscio ematico (con colorazione di Romanowsky) possono interessare sia il nucleo (più raramente) che il citoplasma e sono riportati di seguito in ordine crescente di gravità:

1. Basofilia citoplasmatica: colorazione del citoplasma azzurro – bluastra di intensità variabile, conseguente a una ritenzione o persistenza del reticolo endoplasmatico rugoso (RER) e di poliribosomi che dovrebbero scomparire nei granulociti neutrofili maturi. Se questa alterazione è presente solo nei granulociti neutrofili bandati e non nei segmentati, non è da interpretarsi come segno di tossicità ma dipende dall’immaturità della cellula stessa.
2. Corpi di Dohle: inclusioni citoplasmatiche irregolari, rotondeggianti, angolari, di colazione blu- grigistra di circa 0.5-2 um di diametro, dati da aggregati lamellari persistenti del RER. Nel gatto, a differenza del cane, la loro sola e occasionale presenza può non essere indicativa di tossicità. Possono comparire inoltre come artefatti in seguito a ritardato allestimento del campione come fini puntini bluastri a partire già da 4 ore dal prelievo (Bau‐Gaudreault L e Grimes CL, 2019)
3. Vacuolizzazioni citoplasmatiche: aree irregolari non delimitate da membrana che conferiscono un aspetto schiumoso al citoplasma, date dalla dispersione degli organelli e dalla degranulazione dei lisosomi a livello citoplasmatico per un danno alla membrana cellulare. La presenza di vacuolizzazioni può anche essere artefattuale, sia per ritardo allestimento del campione (degenerazione idropica) sia per contatto prolungato con l’anticoagulante EDTA (Gosset et al., 1984): in questi casi solitamente la basofilia è assente, le vacuolizzazioni tendono ad essere più nette e vi possono essere nuclei picnotici e irregolarità della membrana cellulare, aspetti che devono farci sospettare un’alterazione in vitro.
4. Asincronia maturativa – displasia: caratteristiche discordi all’interno della stessa cellula, come nuclei segmentati (maturi) che presentano cromatina finemente granulare (immatura). Un esempio di tale alterazione è rappresentato dai granulociti neutrofili giganti; queste cellule, di dimensioni superiori a 14-20 um vengono rilasciate troppo rapidamente dal midollo osseo, saltando una divisione cellulare e perciò appaiono di dimensioni maggiori rispetto a un neutrofilo normale. Si osservano più frequentemente nel gatto e sono riportati anche in corso di discrasia del barboncino, infezione da FeLV e trattamento con chemioterapici. Anche i nuclei ad anello sono granulociti neutrofili displastici per accelerata e alterata granulopoiesi.
5. Granuli primari: persistenza nei granulociti neutrofili maturi o bandati di fini granulazioni magenta che solitamente si osservano solo nei promielociti. È un reperto raro da osservare negli animali domestici, più frequente nei cavalli e nei ruminanti, dato da una maggior permeabilità di questi granuli alla colorazione, per la presenza di mucopolisaccaridi al loro interno.

Queste alterazioni sono associate a flogosi per lo più sistemiche, raramente localizzate, spesso di tipo batterico, ma non esclusivamente: patologie virali come la parvovirosi  e i virus delle prime vie respiratorie nel gatto, anemia emolitica immunomediata e coagulazione intravasale disseminata nel cane e alcuni disturbi metabolici, come l’insufficienza renale acuta, la chetoacidosi diabetica e la lipidosi (nel gatto), possono associarsi alla presenza di granulociti neutrofili con segni di tossicità, solitamente meno marcati rispetto a quelli dati da un fenomeno settico grave (Aroch I et al., 2005; Segev G et al., 2006).

Cani con gravi segni di tossicità, associati soprattutto a neutropenia, hanno un tempo di ospedalizzazione e un tasso di mortalità superiore (Aroch I et al., 2005), mentre la risoluzione della tossicità microscopica, in seguito a trattamento, viene interpretato come un fattore prognostico positivo (Schiltze, 2010).

Nel gatto, invece, i segni di tossicità sono associati a un maggior tempo di ospedalizzazione come nel cane, ma non hanno un valore prognostico negativo (Segev G et al., 2006).

Per valutare la gravità di queste alterazioni e conferirgli un significato clinico, si utilizza una classificazione semi – quantitativa basata sia sulla quantità di neutrofili interessati sia sulle alterazioni presenti nel singolo neutrofilo. Di seguito il grading riportato da Harvey JV, Veterinary Hematology, a Diagnostic Guide and Color Atlas (2012).

Dr.ssa Giulia Mangiagalli, DVM – Dr.ssa Silvia Rossi, DVM dipl. ECVCP

Bibliografia:

• Aroch I et al. Clinical, biochemical, and hematological characteristics, disease prevalence, and prognosis of dogs presenting with neutrophil cytoplasmic toxicity. J Vet Intern Med 2005; 19:64–73
• Bau‐Gaudreault L, Grimes CL. Effect of time and storage on toxic or pseudo‐toxic change in canine neutrophils. Vet Clin Pathol. 2019; 48:400–405.
• Gosset KA, MacWilliams PS. Ultrastructure of canine toxic neutrophils. Am J Vet Res. 1982 Sep;43(9):1634-7.
• Gosset KA and Carakostas MC. Effect of EDTA on morphology of neutrophils of healthy
  dogs and dogs with inflammation. Vet Clin Pathol. 1984; 13, 3:22-25.
• Gosset KA et al. Sequential morphological and quantitative changes in blood and bone marrow neutrophils in dogs with acute inflammation. CanJComp Med 1985; 49:291-297.
• Harvey JV. Chapter 5: Evaluation of leukocytic disorders. In: Veterinary Hematology, a Diagnostic Guide and Color Atlas. First Edition. 2012
• Schiltze E. Chapter 48: Interpretation of canine leukocytes response. In: Weiss DJ, Wardrop KJ. Schalm’s Veterinary Hematology. Sixth edition. 2010
• Segev G et al. Toxic neutrophils in cats: clinical and clinicopathologic features, and disease prevalence and outcome – a retrospective case control study. J Vet Intern Med 2006; 20:20–31
• Stockham L, Scott MA. Chapter 2: Leukocytes.In: Fundamentals of Veterinary Clinical Pathology. Second Edition. Blackwell Publ. Ames. 2008.
• Valenciano A et al. Chapter 49: Interpretation of feline leukocytes response. In: Weiss DJ, Wardrop KJ. Schalm’s Veterinary Hematology. Sixth edition. 2010
• Eclinpath.com. https://eclinpath.com/hematology/morphologic-features/white-blood-cells/toxic-change/. Ultimo accesso 06.01.21

Il termine PANNICOLITE comprende un gruppo eterogeneo di patologie multifattoriali caratterizzate da flogosi e, spesso, degenerazione/necrosi del tessuto adiposo sottocutaneo (Gross TL et al., 2005). Frequente nel cane e nel gatto, si presenta come una lesione nodulare sottocutanea singola o multipla, generalmente di consistenza dura, protrudente o non protrudente, ben delimitata, adesa o meno ai piani muscolari sottostanti (fissa o fluttuante), talvolta fistolizzata con fuoriuscita di materiale infiammatorio/necrotico giallo – brunastro oleoso. Le localizzazioni più frequenti sono a livello di torace, addome, collo e porzione prossimale degli arti. La pannicolite può, in una fase successiva, indurre una dermatite profonda o, viceversa, essere la conseguenza dell’estensione più profonda di un processo infiammatorio cutaneo (Jubb et al. 2016).

Dal punto di vista eziopatogenetico può essere di natura infettiva (batterica, micotica, parassitaria) o, più comunemente, non infettiva (sterile). Indipendentemente dalla causa iniziale, gli adipociti danneggiati rilasciano nel sottocute i lipidi presenti nel loro citoplasma; in questa sede avviene la loro lipolisi e saponificazione, con conseguente formazione di acidi grassi proinfiammatori, che potenziano la flogosi già in atto (Gross TL et al., 2005).

La pannicolite sterile può essere causata da: traumi, corpi estranei, reazioni immunomediate (inoculo di farmaci o vaccini (Figura 5 e Figura 6), lupus eritematoso sistemico SLE), deficit nutrizionali (es. carenza di vitamina E nel gatto), vasculiti, ustioni, pancreatiti o carcinomi pancreatici. Nel caso di lesioni pancreatiche, la pannicolite è conseguenza delle vasculiti indotte dalla liberazione degli enzimi pancreatici. Infine, è descritta una pannicolite sterile idiopatica nodulare.

Citologicamente la pannicolite è caratterizzata da una popolazione infiammatoria mista in cui prevalgono macrofagi di aspetto “schiumoso” e granulociti neutrofili, più o meno degenerati, su un caratteristico fondo “lipidico” in cui si osservano numerosi spazi rotondeggianti, di varie dimensioni, otticamente vuoti e adipociti maturi (Figura 1 e Figura 4). Frequente la presenza di piccoli linfociti e plasmacellule (soprattutto nelle reazioni post-vaccinali), cellule giganti multinucleate e cellule fusate di aspetto anche marcatamente reattivo (+++ nelle forme croniche) (Figura 2 e Figura 3). Si può infine osservare una quantità variabile di detrito necrotico.

In caso di pannicolite infettiva, è possibile l’identificazione dell’agente eziologico, ma ricordiamo che il loro mancato riscontro nei preparati citologici non consente di escludere una causa infettiva.

Tra gli agenti eziologici, causa di pannicolite, troviamo Nocardia spp, Actinomycess spp, Bartonella henselae (Rossi MA et al., 2015), Mycobacteria spp, Sporothrix schenckii (raro in Europa), Toxoplasma gondii, Dirofilaria repens. Sono spesso necessari esami colturali e l’esame istologico associato a colorazioni “speciali” per l’identificazione di batteri (colorazione Gram), batteri acido resistenti (Fite-Faraco, Ziehl–Neelsen), funghi (PAS, Grocott-Gomori) (Cowell RL et al., 2008 e Raskin RE et al., 2010).

Non raramente, soprattutto nella specie felina, la fibroplasia reattiva, associata a pannicolite, può essere così intensa da far sospettare un sarcoma (Figura 3). Nei campioni citologici prelevati da queste lesioni, le cellule fusate presenti possono essere caratterizzate da moderati/gravi caratteri di atipia (anisocitosi, anisocariosi, nucleoli multipli evidenti) tali appunto da suggerire una neoplasia a cellule fusate.

In un interessante studio (Kim HJ et al., 2011) viene descritto come sia stata fatta una diagnosi citologica errata di neoplasia in ben 7 cani su 10 con diagnosi istologica finale di pannicolite sterile. In questi campioni citologici falsi positivi provenienti da noduli singoli, ben delimitati e non fluttuanti, era presente una popolazione pressoché singola di cellule fusate pleomorfe con gravi caratteri di atipia.

Poiché talvolta tali quadri rischiano di farci commettere un falso positivo è consigliabile anche di fronte ad atipie marcate della popolazione mesenchimale, soprattutto in presenza dello sfondo lipidico classico e di una popolazione infiammatoria, comprendere tra le diagnosi differenziali oltre alla neoplasia mesenchimale un processo benigno quale la pannicolite o una grave fibroplasia reattiva e consigliare sempre l’esame istologico.

Dr. Gabriele Ghisleni, DVM dipl. ECVCP – Dr.ssa Marta Attini, DVM

Bibliografia:

• Cowell RL, Tyler RD et al. Diagnostic cytology and hematology of the dog and cat. 3°edizione Mosby Elsevier, St.Louis, Missouri, 2008
• Ghisleni G. Atlante di citologia diagnostica del cane e del gatto. Point Veterinaire Italie, Milano, 2006.
• Ghisleni G. Pannicolite, Summa 2008
• Gross TL et al. Skin Diseases of the Dog and Cat: Clinical and Histopathologic Diagnosis. 2°edizione Blackwell Science Ltd, Oxford, UK, 2005
• Jubb, Kennedy and Palmer’s. Pathology of Domestic Animals. Volume 1. 6°edizione Elsevier Saunders, St.Louis, Missouri, 2016
• Kim HJ et al. Sterile panniculitis in dogs: new diagnostic findings and alternative treatments.VetDermatol 22(4):352-359, 2011
• Raskin RE, Meyer DJ. Canine and feline cytology – A Color Atlas and Interpretation Guide. 2°edizione Elsevier Saunders, St.Louis, Missouri, 2010
• Rossi MA et al. Concurrent Bartonella henselae infection in a dog with panniculitis and owner with ulcerated nodular skin lesions. VetDermatol 26(1):60-63, 2015

Didascalie foto:

Figura 1. Cane MGG, 400X. Pannicolite. Popolazione cellulare mista con prevalenza di macrofagi schiumosi, linfociti, sparse singole cellule fusate reattive. Strutture rotondeggianti otticamente vuote riconducibili ad materiale lipidico (Ghisleni, 2008).

Figura 2. Cane MGG, 600X. Pannicolite. È presente una cellula gigante multinucleata (Ghisleni, 2008).

Figura 3. Gatto MGG, 400X. Pannicolite. Popolazione prevalente di cellule di aspetto mesenchimale interpretabili con fibroblasti e-o macrofagi – istiociti; si osserva una cellula gigante multinucleata. Non rari granulociti neutrofili.

Figura 4.  Gatto MGG, 400X. Pannicolite. Popolazione mista di macrofagi schiumosi e granulociti neutrofili non degenerati; sfondo granulare rosato con numerosi spazi otticamente vuoti.

Figura 5. Cane MGG, 400X. Pannicolite da inoculo. Sfondo ematico granulare rosato con vacuoli otticamente vuoti. Popolazione pressochè unica di cellule di aspetto mesenchimale (fibroblasti o cellule istiocitarie – macrofagiche); al centro dell’immagine si osserva fagocitosi di materiale color oro.

Figura 6. Cane MGG, 1000X, stesso caso foto 5. Fagocitosi del materiale inoculato a maggiore ingrandimento.

Il lavaggio bronco – alveolare (BAL) è un campionamento strumentale che consente di raccogliere materiale dalle vie respiratorie profonde ed è indicato in presenza di una patologia polmonare diffusa alveolare e/o interstiziale precedentemente evidenziata tramite esame radiografico e/o tomografico (Andreasen CB, 2003).

Il paziente viene contenuto in anestesia generale, l’esame broncoscopico indica la sede più adatta al prelievo. Questo si effettua mediante un catetere sterile di adeguata lunghezza inserito nel canale operatore del broncoscopio ed introdotto nel lume del bronco oggetto del prelievo. Il materiale cellulare, fisiologico e/o patologico delle vie respiratorie viene raccolto per via indiretta (lavaggio) (Andreasen CB, 2003).

Il lavaggio si effettua mediante l’introduzione nell’albero respiratorio di soluzione fisiologica tiepida in quantità differenti sulla base delle dimensioni del paziente e sul suo immediato recupero (15-30% del liquido inizialmente introdotto). Considerando che il prelievo viene effettuato in anestesia generale, raccogliere contestualmente un campione per la batteriologia, consente nel caso di sospetta flogosi batterica, di effettuare un esame colturale.

I liquidi ottenuti per il lavaggio sono molto acquosi, difficilmente fissabili all’aria e scarsamente cellulari. Pertanto, il liquido prelevato deve essere conservato refrigerato e inviato al laboratorio per la processazione entro brevissimo tempo (1-2 ore) (Nafe LA et al. 2011; Curran M et al. 2020).

Nel caso non sia possibile far pervenire immediatamente il campione in laboratorio, devono essere allestiti dei vetrini del sedimento in questo modo:

• centrifugare ad un numero basso di giri il campione;
• eliminare quasi completamente il surnatante;
• aspirare il pellet sul fondo della provetta con una pipettatrice e depositarne una piccola quantità (2-3 microlitri) su vetrino;
• strisciare il materiale utilizzando la tecnica di strisciamento utilizzata per gli strisci ematici;
• asciugare molto rapidamente.

E’ opportuno inviare in ogni caso in laboratorio parte del campione in provetta K3EDTA unitamente agli strisci preparati. Nel caso in cui debba essere richiesto anche l’esame colturale, una parte del campione deve essere lasciato in siringa o in caso di trasporto prolungato messo in terreno di trasporto idoneo.

In condizioni normali i campioni citologici delle vie aeree profonde prelevati per BAL sono caratterizzati da cellularità moderata/scarsa e costituiti da muco, cellule dell’epitelio respiratorio, cellule infiammatorie (es. macrofagi alveolari). Le cellule dell’epitelio respiratorio sono rappresentate da cellule da colonnari a cuboidali (talvolta ciliate); cellule alveolari cilindriche con nucleo rotondo/ovale e citoplasma debolmente blu; cellule mucipare di forma cilindrica contenenti granuli di mucina citoplasmatici rotondeggianti da rosa a violetto. In alcuni casi i granuli di mucina distendono talmente il citoplasma da conferire alla cellula una forma rotondeggiante (“goblet cells”) (Figura 1).

Il muco presente sul fondo del vetrino può essere granulare di colore blu-violetto o filamentoso, talvolta addensato a formare le “spirali di Curschmann”, di colore violetto e di aspetto simile ad uno scovolino (Figura 2). Le spirali di Curschmann si possono riscontrare in pazienti con eccessiva e cronica produzione di muco e può indicare ostruzione bronchiolare.

I processi infiammatori di maggiore interesse sono di tipo neutrofilico, macrofagico, eosinofilico, linfocitario o misto.

Le flogosi neutrofiliche o purulente sono acute e generalmente ad eziologia batterica. Poiché il mancato riscontro di aspetti degenerativi dei neutrofili e l’assenza di batteri non consentono di escludere una patologia batterica, è fortemente consigliato eseguire anche un esame batteriologico, soprattutto in presenza di flogosi neutrofilica.

Le polmoniti batteriche sono generalmente caratterizzate dalla presenza di granulociti neutrofili con aspetti degenerativi e batteri fagocitati. Una comune infezione polmonare batterica è data da Bordetella bronchiseptica, citologicamente è possibile il riscontro dei coccobacilli pleomorfi aderenti alle cilia delle cellule dell’epitelio respiratorio (Canonne AM et al., 2016).

Nel cane i batteri più comunemente isolati oltre a Bordetella bronchispetica,  sono Mycoplasma, Pasteurella, Enterobcteriaceae e batteri anaerobi (Bacteroides/Prevotella, Preptostreptococcus anaerobius, Porphynomonas spp., Propionobacterius spp., Clostridium spp., Fusobacterium) (Johnson LR et al., 2013).

E’ frequente il riscontro in condizioni normali di batteri contaminanti. La distinzione fra un contaminante e un patogeno viene fatta sulla base dell’assenza di sintomatologia e mancanza di un quadro citologico flogistico associato, oltre che in base alla specie di batterio che viene isolato.

Numerosi sono i virus che possono causare infezioni delle vie respiratorie profonde nel cane e nel gatto. Tra questi adenovirus tipo 2 (CAV-2), herpesvirus del cane (CHV), parainfluenza virus del cane (CPiV), influenza virus del cane (CIV), coronavirus respiratorio del cane (CRCoV), pneumovirus del cane (CnPnV) e calicivirus nel gatto.

Il quadro citologico associato a una infezione virale è aspecifico, spesso caratterizzato dalla presenza di granulociti neutrofili non degenerati. Possibile un aumento del numero di linfociti presenti.

L’infezione virale è frequentemente associata a infezioni batteriche secondarie.

Nel cane viene identificato un complesso delle infezioni respiratorie che può includere varie associazioni fra i virus e i batteri sopra elencati (Day MJ et al., 2020).

Per l’esame batteriologico una parte del campione deve essere lasciato in siringa o in caso di trasporto prolungato va utilizzato un tampone che, dopo essere stato bagnato nel liquido di lavaggio, va inserito nel terreno di trasporto idoneo. Una volta effettuato il prelievo, il tampone va mantenuto a temperatura ambiente e deve giungere in laboratorio contestualmente al liquido. Eventuali terapie antibiotiche devono essere sospese almeno 3-5 giorni prima del prelievo.

Se l’anamnesi e il quadro clinico-patologico fanno sospettare una specifica infezione virale è possibile utilizzare la biologia molecolare (PCR). Questa metodica può essere utilizzata anche per l’identificazione di Bordetella bronchispetica (Canonne AM et al., 2016), in presenza di un sospetto clinico-patologico specifico, a fronte di un esame microbiologico colturale negativo. Per la PCR si può inviare parte del liquido in provetta con K3EDTA ed è possibile conservare il campione fino a 7 giorni refrigerato.

Numerose forme micotiche e protozoarie possono svilupparsi nel contesto del parenchima polmonare. Tra le forme micotiche ritroviamo Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Aspergillus spp, Blastomyces, Coccidioides spp., Pneumocystis carinii e altri funghi opportunisti (Andreasen CB, 2003). Cryptococcus neoformans è più comunemente riscontrabile negli essudati nasali, particolarmente nel gatto, ma è comunque possibile una infezione polmonare che può essere evidenziata nel BAL.

Anche Aspergillus spp è di più comune riscontro a livello nasale che polmonare. Nel pastore tedesco è descritta una aspergillosi sistemica che può essere caratterizzata da un diffuso coinvolgimento polmonare, probabilmente dovuta ad immunodeficienza ereditaria (Andreasen CB, 2003).

Histoplasma capsulatum, Blastomyces, Coccidioides spp. sono funghi che possono dare infezioni polmonari e essere riscontrati nei BAL. Hanno una bassa incidenza in Europa e sono generalmente casi “importati” (Lloret A et al., 2013). Pneumocystis carinii è un fungo patogeno opportunistico, che può essere riscontrato nei BAL sia nella forma cistica (struttura rotondeggiante di 5-10 µm in diametro, contenente da 4 a 8 corpi intracistici) che nella forma simil trofozoitica di 1-2 µm (Weissenbacher-Lang C et al., 2018).

Tra le forme protozoarie ha maggiore rilevanza Toxoplasma gondii, riscontrabile, sia nel gatto che nel cane, in corso di infezioni sistemiche polmonari (Andreasen CB, 2003). Citologicamente i tachizoiti di Toxoplasma gondii sono osservabili come piccoli corpi (5×2µm) di forma da rotondeggiante a mezzaluna, con citoplasma leggermente blu e nucleo paracentrale.

Le flogosi eosinofiliche sono generalmente su base allergica (Figura 3) o parassitaria, ma anche micotica o neoplastica (Johnson LR et al., 2019). Nel cane esiste una specifica condizione patologica, la broncopneumopatia eosinofilica (BPE) su base allergica che colpisce cani giovani o di età media, clinicamente associata a tosse e scolo nasale (Johnson LR et al., 2019). Radiograficamente, è caratterizzata da bonchiectasie e citologicamente da infiltrato prevalentemente eosinofilico.

Infine, segnaliamo che nel cane non è infrequente il riscontro nei preparati citologici di un elevato numero di linfociti (>20% delle cellule totali) in risposta ad una lesione delle vie aeree, indipendentemente dal tipo o dalla durata della patologia in atto (Johnson LR and Vernau W, 2019).

L’emorragia polmonare è citologicamente caratterizzata da reperti di eritrofagocitosi da parte dei macrofagi alveolari. La fagocitosi di eritrociti ancora ben riconoscibili è segno di un episodio emorragico recente; poiché l’eritrofagocitosi può avvenire anche in vitro, per evitare questo “artefatto” è consigliabile processare immediatamente il campione prelevato.

Il riscontro nel citoplasma dei macrofagi di prodotti di degradazione eritrocitaria (emosiderina ed ematoidina) è invece segno di un episodio emorragico non recente. Secondo un recente studio di Hooi et al. (2018), questo reperto si riscontra maggiormente nella specie felina a causa di una ridotta capacità di degradazione dell’emosiderina da parte dei macrofagi alveolari e una maggior suscettibilità all’emorragia. La colorazione “speciale” Blu di Perls permette di differenziare l’emosiderina (che si colora di blu) da altro tipo di pigmento nerastro (es. pigmento antracotico di frequente riscontro) che non si colora di blu.

Nel cane e gatto, le emorragie polmonari possono essere causate da: traumi, filariosi, corpi estranei inalati, torsione di un lobo polmonare, infezioni (batteriche e micotiche), parassiti, insufficienza cardiaca, embolia polmonare, coagulopatie e neoplasie (primarie o metastatiche). Si deve considerare che il riscontro di eritrociti in un BAL non depone necessariamente per una emorragia polmonare, infatti può essere dovuto alla contaminazione ematica causata dal trauma del campionamento. E’ altresì possibile che campioni di BAL ematici, non rapidamente processati, siano caratterizzati da eritrofagocitosi recente post-prelievo.

Angiostrongylus vasorum, Aelurostrongylus abstrusus (Figura 4), Crenosoma vulpis possono causare patologie polmonari nel cane e nel gatto ed essere identificati in campioni ottenuti da noduli polmonari, lavaggi tracheali o broncoalveolari. Sono le larve e le uova a indurre la risposta infiammatoria, non gli adulti. Le larve si presentano nei preparati citologici la maggior parte delle volte avvolte a spirale. Sono accompagnate da una flogosi mista, con una buona componente eosinofilica. Per la distinzione di specie in base a criteri morfologici si rimanda ai testi di parassitologia.

Le neoplasie polmonari possono presentarsi in forma nodulare, singola o multipla, o in forma diffusa. Le lesioni nodulari è preferibile siano campionate citologicamente tramite ago aspirato o ago infissione. Sia le neoplasie nodulari che diffuse, se non coinvolgono o infiltrano l’albero bronchiale, non esfoliano cellule nel BAL e non sono pertanto diagnosticabili con questa tecnica di prelievo.

I tumori primari polmonari più frequenti sono i carcinomi e in particolare gli adenocarcinomi. Sono caratterizzati da cellule epiteliali con marcati caratteri di atipia, se sono presenti strutture simil-acinari o è presente materiale di secrezione sono classificabili come adenocarcinomi. Possibili come neoplasie primarie polmonari il linfoma e il sarcoma istiocitario. Si ricorda la possibilità di metastasi polmonare di numerose neoplasie epiteliali (es. carcinomi mammari) (Pavelski M et al., 2017) e mesenchimali (es. osteosarcoma, angiosarcoma).

Va ricordato che in corso di flogosi è possibile il riscontro di epitelio respiratorio con caratteri di iperplasia e displasiache possono mimare una condizione neoplastica (Figura 5). Le cellule epiteliali iperplastiche si possono presentare in piccoli gruppi fortemente coesivi con aumento del rapporto N:C, nuclei ipercromatici, citoplasma intensamente colorato. Caratteri di displasia sono una lieve/moderata anisocitosi, anisocariosi e “nuclear molding”. La “conservazione” delle cilia in queste cellule epiteliali respiratorie atipiche aiuta nel differenziare una displasia da una neoplasia. Ovviamente il quadro clinico-radiografico aiuta nella diagnosi differenziale.

Va segnalata in cani clinicamente sani la metaplasia peribronchiale (Lambertosis): è una forma di iperplasia dell’epitelio dei bronchioli terminali. Le cellule iperplastiche non presentano caratteri di atipia.

Dr. Gabriele Ghisleni – DVM, ECVCP Dipl.

Didascalie immagini

• Figura 1- Cane, lavaggio bronco-alveolare, May Grünwald-Giemsa, x600. Flogosi mista aspecifica con componete allergica-iperergica. È presente una “goblet cell” (A), cellule epiteliali cilindriche ciliate (B), granulociti neutrofili non degenerati (C), granulociti eosinofili (D) e macrofagi (E).
• Figura 2- Cane, lavaggio bronco-alveolare, May Grünwald-Giemsa, immersione. Spirale di Curschmann. (Ghisleni, 2006).
• Figura 3 – Gatto, lavaggio bronco-aveolare, May Grünwald-Giemsa, x600. Pneumopatia allergico-iperergica (probabile polmonite interstiziale eosinofilica) complicata da flogosi neutrofilica. Campione caratterizzato dalla presenza di una popolazione mista di cellule con prevalenza di eosinofili nonché neutrofili non degenerati e senza evidente fagocitosi batterica. (Ghisleni, 2006)
• Figura 4 – Gatto, lavaggio bronco-aveolare, cytospin, May Grünwald-Giemsa, x100. Polmonite verminosa. Campione con elevata cellularità, con una popolazione infiammatoria mista associata alla presenza di uova e larve, molto probabilmente di Aleurostrongylus abstrusus.
• Figura 5 – Cane, femmina 3 anni, lavaggio bronco-alveolare, cytospin, May Grünwald-Giemsa, x600. Flogosi mista aspecifica con iperplasia/displasia dell’epitelio. Campione con buona cellularità, caratterizzato dalla presenza di una popolazione mista di cellule con prevalenza di neutrofili non degenerati e senza evidentefagocitosi batterica. Eosinofili, macrofagi, linfociti ed epitelio respiratorio che mostra qualche reperto di iperplasia/displasia. (Ghisleni, 2006)

Bibiografia

• Andreasen CB. Bronchoalveolar lavage. Vet Clin Small Anim 33: 69–88, 2003
• Canonne AM , Billen  F , Tual  C , Ramery  E , Roels  E , Peters  I , Clercx  Quantitative PCR and Cytology of Bronchoalveolar Lavage Fluid in Dogs with Bordetella bronchiseptica infection. J Vet Intern Med 30(4):1204-9, 2016.
• Curran M , Boothe  DM , Hathcock  TL , Lee-Fowler  Analysis of the effects of storage temperature and contamination on aerobic bacterial culture results of bronchoalveolar lavage fluid. J Vet Intern Med 34(1):160-165, 2020.
• Day MJ , Carey  S , Clercx  C , Kohn  B , MarsilIo  F , Thiry  E , Freyburger  L, Schulz  B , Walker  Aetiology of Canine Infectious Respiratory Disease Complex and Prevalence of its Pathogens in Europe. J Comp Pathol 176:86-108, 2020.
• Ghisleni G. Atlante di citologia diagnostica del cane e del gatto. Point Veterinaire Italie, Milano, 2006.
• Hooi KS et al. Bronchoalveolar lavage hemosiderosis in dogs and cats with respiratory disease. Vet Clin Pathol 48 (1): 42-49, 2019
• Johnson LR , Queen EV, Vernau W, Sykes JE, Byrne BA. Microbiologic and cytologic assessment of bronchoalveolar lavage fluid from dogs with lower respiratory tract infection: 105 cases (2001-2011). J Vet Intern Med 27(2):259-67, 2013.
• Johnson LR, Johnson EG, Hulsebosch SE, Dear JD, Vernau W. Eosinophilic bronchitis, eosinophilic granuloma, and eosinophilic bronchopneumopathy in 75 dogs (2006-2016). J Vet Intern Med. 2019 Sep;33(5):2217-2226, 2019
• Johnson LR and Vernau W. Bronchoalveolar lavage fluid lymphocytosis in 104 dogs (2006-2016). J Vet Intern Med 33 (3): 1315-1321, 2019
• Nafe LA , DeClue AE, Reinero CR. Storage alters feline bronchoalveolar lavage fluid cytological analysis. J Feline Med Surg  13(2):94-100, 2011.
• Pavelski M , Correa Leite  N , Pedri  E , Guérios  SD , De Sousa  RS , Rodrigues Froes  T , Triches Dornbusch  Single-aliquot, non-bronchoscopic bronchoalveolar lavage in the diagnosis of metastatic mammary tumours in dogs. J Small Anim Pract . 58(3):168-173, 2017.
• Burkhard M.J. Respiratory tract. In Raskin R.E. Meyer D.J. (Eds): Canine and feline cytology. A color atlas and interpretation guide, Mosby Elsevier, St. Louis, 2016; pp. 138-190.
• Weissenbacher-Lang C , Fuchs-Baumgartinger  A , Abigail Guija-De-Arespacochaga  A, Klang  A , Weissenböck  H , Künzel  Pneumocystosis in dogs: meta-analysis of 43 published cases including clinical signs, diagnostic procedures, and treatment. J Vet Diagn Invest . 30(1):26-35, 2018.