Patologia clinica

Il mio paziente è davvero iperkaliemico ed ipocalcemico? Attenzione agli errori preanalitici!

Il kEDTA (acido etilendiamminotetracetico) è l’anticoagulante raccomandato ed utilizzato più comunemente nell’esame emocromocitometrico per la valutazione delle componenti cellulari e della loro morfologia sia in Medicina Veterinaria (come k3EDTA) che in Medicina Umana.

Spesso, nell’effettuare un prelievo di sangue venoso in un paziente, viene riempita prima la provetta per l’esame emocromocitometrico (per evitare che il sangue coaguli velocemente) e poi la provetta vuota/contenente gel per il siero. In questo modo però, può avvenire una contaminazione del siero con il kEDTA che determina contestualmente un aumento della concentrazione di Potassio K (iperkaliemia) ed una diminuzione della concentrazione di Calcio Ca (ipocalcemia). Tali alterazioni pre-analitiche, talvolta anche gravi e chiaramente incompatibili con la vita, sono artefattuali, non sono correlate ad altre alterazioni clinico-patologiche che potrebbero spiegarne la causa e rendono del tutto inaccurate le misurazioni del Potassio e del Calcio.

Il kEDTA contenuto nelle provette per l’esame emocromocitometrico contiene Potassio ed impedisce la formazione del coagulo chelando il Calcio. Inoltre produce legami covalenti anche con altri ioni (Magnesio, Zinco, Rame) e può inficiare la misurazione di altri parametri biochimici quali ALP (determinando valori più bassi), Ferro, UIBC, bicarbonato, ammonio, AST, ALT, LDH, CK ed amilasi.

Vi ricordiamo che anche un semplice contatto del cono della siringa con l’anticoagulante kEDTA (presente non solo sul fondo ma anche su tappo e pareti) può esitare in una contaminazione.

In Medicina Umana diversi articoli riportano questo errore pre- analitico con discreta frequenza, vale a dire nel 20% circa di tutti i campioni con iperkalemia, e consigliano sempre la misurazione del kEDTA nei sieri iperkaliemici (≥ 6 mmol/L). Tale errore può essere dovuto principalmente a 3 meccanismi:

• Diretto trasferimento di sangue venoso dalla provetta con kEDTA in altre provette;
• Contaminazione della siringa per contatto con l’anticoagulante kEDTA;
• Rigurgito di sangue dalle provette sterili sottovuoto (sistema Vacutainer) nell’ago o addirittura in vena

Anche se non vi sono molti studi a riguardo, tale errore viene riscontrato anche in Medicina Veterinaria. Nel lavoro di Nielsen et al., in 74 campioni su 238 che avevano un rapporto sodio:potassio basso (circa il 31%) è stata sospettata una contaminazione con kEDTA (campioni con iperkalemia e ipocalcemia) e questi pazienti sono perciò stati esclusi dallo studio sul rapporto sodio:potassio.

Quando possiamo quindi sospettare che sia avvenuta questa contaminazione?

• Quando ipocalcemia e iperkalemia sono talmente marcate da essere incompatibili con la vita o comunque talmente severe che dovrebbero dare una sintomatologia clinica grave e conclamata (ad esempio tremori, convulsioni, aritmie cardiache);
• Quando non ci sono altre alterazioni biochimiche correlate a queste due alterazioni (ad esempio insufficienza renale acuta);
• Quando anche se lievi, queste due alterazioni non trovano spiegazioni nel quadro clinico e clinico-patologico.

In questi casi l’unica soluzione per confermare la contaminazione resta ripetere il prelievo utilizzando esclusivamente la provetta da siero.

Il nostro Laboratorio consiglia nel caso in cui debbano essere inviati sia siero che sangue in k3EDTA, di riempire per prima la provetta per il siero.

Bibliografia:

• Asif U et al. Preanalytical potassium EDTA sample contamination: oper versus closed phlebotomy system. Ann Clin Biochem 56(6): 711- 714, 2019
• Chadwick K et al. kEDTA sample contamination: a reappraisal. J App Lab Med 3(6): 925- 935, 2019
• Cornes MP et al. Spurious hyperkalaemia due to EDTA contamination: common and not always easy to identify. Ann Clin Biochem 45(6): 601- 603, 2008
• Ijaz A et al. EDTA contamination in laboratory specimens- effect of an awareness campaign. J Coll Physicians Surg Pak 20 (6): 405- 407, 2010
• Nielsen L et al. Low ratio of sodium to potassium in the serum of 238 dogs. Vet Rec 162 (14): 413- 435, 2008

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Linfocitosi Matura nel Cane e nel Gatto

I linfociti sono la seconda popolazione numericamente presente nel sangue sia nel cane che nel gatto. La linfocitosi è un’alterazione abbastanza aspecifica e si verifica in corso sia di condizioni “parafisiologiche” sia in corso di patologie parassitarie, virali, batteriche, neoplastiche, endocrine ed immunomediate. Indagare questa alterazione ematologica avendo un ventaglio ampio di ipotesi diagnostiche, può essere una sfida per il clinico.

Quale è l’approccio diagnostico consigliato in corso di linfocitosi matura? Specifichiamo matura perché è evidente che la presenza di linfociti immaturi, atipici orienta verso differenziali unicamente neoplastiche. Dobbiamo innanzitutto rispondere a queste domande:

Di che entità numerica è la linfocitosi?

Aumenti lievi e moderati hanno numerose diagnosi differenziali, ma aumenti molto marcati (maggiori di 50-60.000 linfociti/microlitro) restringono il campo alle forme neoplastiche (leucemia linfocitica cronica, linfoma di basso grado V stadio).

Il paziente presenta un quadro clinico e clinico-patologico che possono chiaramente spiegarci la linfocitosi?

Il dato deve sempre essere interpretato insieme a segnalamento, anamnesi, quadro clinico e altri dati clinico-patologici avendo in mente l’elenco delle possibili diagnosi differenziali (vedi sotto).

La linfocitosi è persistente e/o ingravescente?

Quando viene rilevata una linfocitosi inspiegabile (paziente asintomatico oppure non è possibile identificare una causa), il primo passo è ripetere nel tempo l’esame emocromocitometrico per valutarne l’andamento. Linfocitosi transitorie parafisiologiche sono ad esempio quelle post-vaccinali, quelle del cucciolo (intervalli di riferimento diversi dall’adulto) o quelle secondarie al rilascio di catecolamine (nel gatto, in seguito a stress acuto). Una linfocitosi persistente anche in assenza di segni o sintomi clinici deve sempre essere approfondita. Nel caso in cui il numero dei piccoli linfociti tenda ad aumentare nel tempo, è più probabile che si tratti di una forma neoplastica.

Le cause di linfocitosi matura sono:

• Fisiologica, legata all’età (cuccioli e gattini)
• Indotta da stress acuto (gatto)
• Reazione immunitaria post vaccinale
• Patologie parassitarie (es: Leishmania, Toxoplasma, Babesia, Spirocerca lupi)
• Patologie batteriche (es: Bartonella henselae (gatto) ed Ehrlichia)
• Patologie virali (es: FeLV)
• Anemia emolitica immunomediata (gatto)
• Linfoma a piccole cellule V stadio
• Leucemia linfocitica cronica (CLL)
• Timoma
• Morbo di Addison
• Ipertiroidismo (gatto)

Linfocitosi inspiegabili e citometria a flusso

In assenza di condizioni cliniche e/o alterazioni clinico- patologiche (ivi compresi test per malattie infettive negativi ad esempio) che indirizzino verso una delle diagnosi differenziali qui sopra elencate e dopo aver confermato la persistenza della linfocitosi matura, il test meno invasivo e che può fornirci indicazioni essenziali è l’immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso. Attraverso questa analisi è possibile nella maggior parte dei casi distinguere le linfocitosi reattive (infiammatorie, infettive) da quelle neoplastiche e in alcuni casi, in presenza di determinati fenotipi, giungere a una diagnosi definitiva (linfoma, leucemia). Nei casi in cui l’immunofenotipizzazione non fornisca risposte definitive, è consigliabile richiedere l’analisi della clonalità linfoide (PARR).

 

Bibliografia:

• Schalm’s Veterinary Hematology. Weiss DJ, Wardrop KJ. Sixth edition. 2010
• Veterinary Hematology, a Diagnostic Guide and Colour Atlas. Harvey JV. First Edition. 2012
• Avery AC, Avery PR. Determining the significance of persistent lymphocytosis. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2007 Mar; 37(2):267-82, vi.

 

 

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Agglutina o non agglutina? Questo è il dilemma! Lavaggio degli eritrociti con soluzione fisiologica (Saline Agglutination Test)

La diagnosi di anemia emolitica immunomediata (IMHA) si basa sulla presenza di una serie di alterazioni clinico-patologiche che tanto più sono presenti tanto più la supportano. Tra le più importanti ricordiamo:

• Presenza di sferociti (solo cane)
• Presenza di ghost cells (cane e gatto)
• Agglutinazione
• Iperbilirubinemia, bilirubinuria
• Policromasia (rigenerazione)
• Test di Coombs o anticorpi anti eritrociti positivi

La diagnosi viene considerata “facile” quando sono presenti più di 2-3 di queste alterazioni. Sfortunatamente esistono casi seppur meno frequenti in cui nessuna di esse è presente, come ad esempio in corso di IMHA nei confronti dei precursori midollari.

Tra quelle citate forse la più importante e dotata di maggiore specificità per IMHA è la presenza di autoagglutinazione. Il principio per il quale si sviluppa agglutinazione è che gli eritrociti ricoperti di antigeni e anticorpi si “appiccicano” in modo piuttosto forte tra di loro, venendo a formare dei grappoli più o meno voluminosi. Se ne può sospettare la presenza osservando macroscopicamente il campione in provetta (FOTO 1), oppure mettendo un paio di gocce di sangue su un vetrino (FOTO 2); anche la lettura strumentale del campione risulta frequentemente alterata, con presenza di macrocitosi estrema e aumento inverosimile di MCHC.  In tutti questi casi la sospetta agglutinazione deve essere confermata eseguendo un lavaggio con soluzione fisiologica; questo test serve ad escludere che possa trattarsi di pseudo-agglutinazione (FOTO 3), causata dalla presenza di rouleaux (FOTO 4).

Si tratta di un test di facile esecuzione, che ciascuno può effettuare presso la propria struttura. La corretta procedura prevede di miscelare sangue da provetta EDTA con soluzione fisiologica in rapporto da 1:4 a 1:10; per non inondare il vetrino conviene utilizzare una eppendorf vuota, poi risospendere il campione e porre una goccia su vetrino. A questo punto sulla goccia viene posto un coprioggetto e il vetrino viene osservato al microscopio chiudendo il diaframma (come quando si esamina il sedimento urinario). In caso di pseudoagglutinazione gli eritrociti si staccano uno dall’altro e fluttuano liberi nella soluzione (FOTO 5), mentre in caso di agglutinazione si visualizzano ancora i grappoli (FOTO 6).

Rilevare la presenza di agglutinazione è estremamente utile per indirizzare il sospetto diagnostico: alcuni lavori hanno stabilito per questo test una specificità molto elevata (85-100%), che significa che è estremamente improbabile che un paziente che agglutina non abbia una IMHA (falso positivo). Viceversa, un test negativo non consente di escludere del tutto un’emolisi immunomediata poiché in non rari casi non sono presenti immunoglobuline in grado di formare legami forti. Un test di agglutinazione positivo consente anche di evitare ulteriori approfondimenti quali il test di Coombs o la ricerca di anticorpi anti-eritrocita, test che invece sono fortemente consigliati quando vi è il sospetto di IMHA ma non sono presenti le alterazioni classiche sopraelencate.

Bibliografia:

• Garden OA et al. ACVIM consensus statement on the diagnosis of immune- mediated hemolytic anemia in dogs and cats. 2019. J Vet Intern Med.;1–22.
• Caviezel LL, Raj K, Giger U. Comparison of 4 direct Coombs' test methods with polyclonal antiglobulins in anemic and nonanemic dogs for in-clinic or laboratory use. 2014 J Vet Intern Med. 28:583-591.
• Paes G. et al.The use of the rapid osmotic fragility test as an additional test to diagnose canine immune-mediated haemolytic anaemia. Acta Vet Scand; 55:74.
• http://eclinpath.com/hematology/morphologic-features/red-blood-cells/patterns/

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Alterazioni morfologiche eritrocitarie: Sferocitosi

Gli sferociti sono eritrociti sfericizzati in seguito alla parziale fagocitosi di una parte della loro membrana da parte dei macrofagi: il classico pallore centrale non è più evidente e appaiono più piccoli degli altri eritrociti semplicemente perché sono rigonfi e non più piatti, ma il loro volume non è inferiore a quello degli altri RBC.  Gli sferociti sono facilmente identificabili nel cane, mentre nel gatto è praticamente impossibile distinguerli dagli eritrociti normali poiché questi ultimi mancano del pallore centrale; nella specie felina si utilizzano come marker di emolisi le ghost cells.

La sferocitosi marcata è patognomonica per anemia emolitica immuno-mediata (IMHA): gli eritrociti ricoperti da immunoglobuline vengono letteralmente morsicati dai macrofagi di fegato e milza (emolisi extravascolare) perdendo così la loro forma a disco biconcavo. Altre cause di sferocitosi meno comuni riportate in letteratura includono: danno ossidativo (zinco, paracetamolo), morso di vipera o di vespa, disordini istiocitari emofagocitici, deficienza dell’enzima piruvato chinasi nel Basenji, diseritropoiesi ed altre patologie che possono essere causa di frammentazione degli eritrociti (es. microangiopatie). In tutti questi casi il loro numero generalmente non è elevato.

In un paziente anemico, la presenza di ≥ 5 sferociti per campo ad immersione 100x è suggestiva di anemia emolitica immuno-mediata (IMHA) (63% sensibilità, 95% specificità). Quando si esamina lo striscio è molto importante scegliere l’area corretta dove identificarli: non verso la coda dove spesso tutti gli eritrociti sembrano perdere il pallore centrale (FOTO 1 cane, coda dello striscio non patologico), bensì nel corpo dello striscio, dove comunque è presente un monostrato (FOTO 2 cane, corpo dello striscio non patologico).

Nella maggior parte dei casi riconoscerli nel cane è semplice (FOTO 3 cane, anemia emolitica immunomediata dove sono visibili chiaramente sferociti); il caso più ingannevole nella nostra esperienza si verifica quando TUTTI gli eritrociti sono sferociti, per cui non avendo paragoni con eritrociti “sani” col pallore centrale, possono sfuggire. In questi casi è di fondamentale importanza valutare il caso nell’insieme: se il paziente è anemico, agglutina, rigenera, magari è anche itterico, deve venirci il dubbio che si tratti di una popolazione unica di sferociti! (FOTO 4 cane, anemia emolitica immunomediata con numerosissimi sferociti)

Bibliografia:

• Garden OA et al. ACVIM consensus statement on the diagnosis of immune- mediated hemolytic anemia in dogs and cats. Journal of Veterinary Internal Medicine: 1–22, 2019
• Harvey JV. Veterinary Hematology, a Diagnostic Guide and Color Atlas. First Edition Elsevier, 2012
• Stockham SL and Scott MA. Fundamentals of Veterinary Clinical Pathology. Second edition Blackwell, 2008

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Angiostrongilosi ed Elettroforesi

L’Angiostrongilosi canina è una malattia parassitaria causata da Angiostrongylus vasorum, nematode che si localizza nella forma adulta nelle arterie polmonari e nel cuore destro del cane (ospite definitivo). È una patologia emergente in Italia come in tutta Europa, sia perché negli ultimi anni è aumentata l’attenzione nei confronti della patologia che viene più spesso ricercata anche attraverso screening sierologici, sia per l’aumento dei vettori (chiocciole e lumache) e dei serbatoi (volpi) nelle aree periurbane.

Questa malattia ha una presentazione clinica molto variabile, tanto che Angiostrongilo è stato definito il grande imitatore.  

La forma acuta (infrequente) è caratterizzata da insufficienza cardiaca destra acuta (tosse, sincopi, versamento addominale ed epatomegalia); la forma cronica è caratterizzata dal progressivo peggioramento delle funzionalità respiratoria e cardiaca e dall’alterazione della coagulazione (trombocitopenia, DIC, iperfibrinogenolisi) causando diatesi emorragica. La comparsa della sintomatologia neurologica è conseguente a emorragie intracraniche o a embolie, secondarie ai disturbi della coagulazione. Se non trattata per tempo, la patologia può essere letale.

Proprio perché può essere complesso stabilire la probabilità di malattia solo sulla base del quadro clinico, alcune alterazioni di laboratorio diventano particolarmente utili per orientare il sospetto diagnostico, e tra queste ricordiamo l’elettroforesi sierica: un incremento della frazione β delle globuline, soprattutto quando non associato ad aumento di altre classi, in un paziente che vive o ha soggiornato in area endemica per questa patologia deve sempre farci annoverare tra le diagnosi differenziali quella di angiostrongilosi.

La diagnosi viene in genere effettuata mediante il test di Baermann su triplice raccolta di feci (un campione per 3 giorni consecutivi) o con un test sierologico antigenico immunocromatografico su siero.

Altre alterazioni clinico-patologiche che possono essere riscontrate in modo incostante sono: trombocitopenia, eosinofilia, alterazioni del profilo coagulativo esteso (DIC cronica o scompensata) anemia, ipercalcemia;alcuni test antigenici per Dirofilaria Immitis possono risultare falsamente positivi (cross-reattività).

Tra le altre e più frequenti cause di aumento delle beta globuline ricordiamo:

• Infiammazione acuta (solitamente con aumento concomitante delle α globuline)
• Infiammazione cronica (solitamente con aumento concomitante delle γ globuline)
• Sindrome nefrosica (solitamente con aumento concomitante delle α globuline)
• Aumento delle immunoglobuline IgM e IgA (solitamente con aumento concomitante delle γ globuline)
• Epatopatie, enteropatie croniche
• Neoplasie ematopoietiche (es. mieloma multiplo, linfoma, leucemia)
• Emolisi marcata (interferenza analitica)

Bibliografia:

• Adamantos et al. Coagulation status in dogs with naturally occurring Angiostrongylus vasorum infection. 2015. S. J Small Anim Pract. Aug;56(8):485-90
• Wessmann A. et al. Brain and spinal cord haemorrhages associated with Angiostrongylus vasorum infection in four dogs Vet Rec. Jun 24;158(25):858-63.
• Chapman PS et al.   Angiostrongylus vasorum infection in 23 dogs (1999-2002). 2004. Journal of Small Animal Practice 45: 435–440.
• Paradies P et al. Canine Angiostrongylosis in naturally infected dogs: clinical approach and monitoring of infection after treatment. 2013. Scientific World Journal .Dec 29;2013:702056
• https://www.fecava.org/files/ckfinder/files/CVBD_Angiostrongylosis_final.pdf
• Schnyder M, Deplazes P. Cross-reactions of sera from dogs infected with Angiostrongylus vasorum in commercially available Dirofilaria immitis test kits. 2012 Parasit Vectors. Nov 13;5:258.

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