Agglutina o non agglutina? Questo è il dilemma! Lavaggio degli eritrociti con soluzione fisiologica (Saline Agglutination Test)


La diagnosi di anemia emolitica immunomediata (IMHA) si basa sulla presenza di una serie di alterazioni clinico-patologiche che tanto più sono presenti tanto più la supportano. Tra le più importanti ricordiamo:

  • Presenza di sferociti (solo cane)
  • Presenza di ghost cells (cane e gatto)
  • Agglutinazione
  • Iperbilirubinemia, bilirubinuria
  • Policromasia (rigenerazione)
  • Test di Coombs o anticorpi anti eritrociti positivi

La diagnosi viene considerata “facile” quando sono presenti più di 2-3 di queste alterazioni. Sfortunatamente esistono casi seppur meno frequenti in cui nessuna di esse è presente, come ad esempio in corso di IMHA nei confronti dei precursori midollari.

Tra quelle citate forse la più importante e dotata di maggiore specificità per IMHA è la presenza di autoagglutinazione. Il principio per il quale si sviluppa agglutinazione è che gli eritrociti ricoperti di antigeni e anticorpi si “appiccicano” in modo piuttosto forte tra di loro, venendo a formare dei grappoli più o meno voluminosi. Se ne può sospettare la presenza osservando macroscopicamente il campione in provetta (FOTO 1), oppure mettendo un paio di gocce di sangue su un vetrino (FOTO 2); anche la lettura strumentale del campione risulta frequentemente alterata, con presenza di macrocitosi estrema e aumento inverosimile di MCHC.  In tutti questi casi la sospetta agglutinazione deve essere confermata eseguendo un lavaggio con soluzione fisiologica; questo test serve ad escludere che possa trattarsi di pseudo-agglutinazione (FOTO 3), causata dalla presenza di rouleaux (FOTO 4).

Si tratta di un test di facile esecuzione, che ciascuno può effettuare presso la propria struttura. La corretta procedura prevede di miscelare sangue da provetta EDTA con soluzione fisiologica in rapporto da 1:4 a 1:10; per non inondare il vetrino conviene utilizzare una eppendorf vuota, poi risospendere il campione e porre una goccia su vetrino. A questo punto sulla goccia viene posto un coprioggetto e il vetrino viene osservato al microscopio chiudendo il diaframma (come quando si esamina il sedimento urinario). In caso di pseudoagglutinazione gli eritrociti si staccano uno dall’altro e fluttuano liberi nella soluzione (FOTO 5), mentre in caso di agglutinazione si visualizzano ancora i grappoli (FOTO 6).

Rilevare la presenza di agglutinazione è estremamente utile per indirizzare il sospetto diagnostico: alcuni lavori hanno stabilito per questo test una specificità molto elevata (85-100%), che significa che è estremamente improbabile che un paziente che agglutina non abbia una IMHA (falso positivo). Viceversa, un test negativo non consente di escludere del tutto un’emolisi immunomediata poiché in non rari casi non sono presenti immunoglobuline in grado di formare legami forti. Un test di agglutinazione positivo consente anche di evitare ulteriori approfondimenti quali il test di Coombs o la ricerca di anticorpi anti-eritrocita, test che invece sono fortemente consigliati quando vi è il sospetto di IMHA ma non sono presenti le alterazioni classiche sopraelencate.

Bibliografia:

  • Garden OA et al. ACVIM consensus statement on the diagnosis of immune- mediated hemolytic anemia in dogs and cats. 2019. J Vet Intern Med.;1–22.
  • Caviezel LL, Raj K, Giger U. Comparison of 4 direct Coombs’ test methods with polyclonal antiglobulins in anemic and nonanemic dogs for in-clinic or laboratory use. 2014 J Vet Intern Med. 28:583-591.
  • Paes G. et al.The use of the rapid osmotic fragility test as an additional test to diagnose canine immune-mediated haemolytic anaemia. Acta Vet Scand; 55:74.
  • http://eclinpath.com/hematology/morphologic-features/red-blood-cells/patterns/
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