La biopsia cutanea: quando, come, perché eseguirle – Dr. Chiara Noli

Per evitare di ricevere laconici reperti di “dermatite cronica” è importante sapere selezionare gli animali da cui prelevare una biopsia, identificare le lesioni più adatte da inviare al laboratorio e compiere un prelievo a regola d’arte

Indicazioni
La biopsia cutanea è indicata nelle seguenti situazioni:
– se le lesioni hanno un aspetto inconsueto
– se la malattia non migliora nonostante le terapie che parevano più adatte
– se si sospetta una malattia che necessita di terapia per lunghi periodi e che non sia diagnosticabile in altro modo (ad esempio per sospetto di malattia autoimmune)
– se si sospetta una malattia che necessita di terapia che può essere pericolosa o controindicata per l’animale e che non sia diagnosticabile in altro modo (ad esempio malattia autoimmune)
– se si sospetta un tumore e se ne vuole identificare la natura prima dell’intevento di escissione (ad esempio mastocitoma) o dove sia impossibile eseguire un’escissione chirurgica (ad esempio linfoma epiteliotropo) e l’esame citologico non sia diagnostico
– in caso di alopecia non infiammatoria ove si siano escluse tutte le cause ormonali
– in caso di prurito ove si siano escluse tutte le cause parassitarie, allergiche e infettive
– in caso di sospetto di malattie congenite (ad esempio nevi)
– in caso di difetti di cheratinizzazione (ad esempio adenite sebacea)
– in generale in ogni caso di dubbio diagnostico

Preparazione dell’animale
Se le condizioni dell’animale lo permettono, è preferibile eseguire le biopsie dopo la somministrazione di una o due settimane di antibiotico, in modo da eliminare infezioni batteriche complicanti che potrebbero disturbare la lettura istologica. A questo scopo si preferisce somministrare cefadroxil 20-30 mg/kg SID, cefalessina 20-30 mg/kg BID o amoxicillina e acido clavulanico 20-25 mg/kg BID. La terapia antibiotica deve venire protratta sino a una settimana dopo il prelievo della biopsia, in modo da evitare che si infettino le ferite e che si formino cicatrici troppo evidenti. Nel caso che l’animale sia stato sottoposto a terapia cortisonica, sempre che le condizioni del paziente permettano di posticipare il prelievo della biopsia, è meglio aspettare 15-20 giorni dalla sospensione della terapia steroidea.

Preparazione del campo
Per il prelievo di biopsie cutanee è importante non eseguire una tricotomia radicale e una disinfezione chirurgica, per evitare di rimuovere gli strati più superficiali dell’epidermide che sono spesso importanti per la diagnosi (croste, pustole, squame). E’ importante tagliare il pelo con una forbice da pelo, ad una lunghezza di 0,5 cm, facendo attenzione di lasciare le lesioni intatte. La presenza di peli troppo lunghi dà fastidio al momento dell’esecuzione del prelievo e della lavorazione della biopsia, mentre se il pelo viene tagliato troppo corto (meno di 5mm) risulta poi difficoltoso per il laboratorio orientare la biopsia per la lavorazione istologica. E’ sufficiente poi spruzzare un poco di disinfettante incolore sulle lesioni da prelevare e lasciarlo evaporare senza tamponare la superficie cutanea. Se si esegue il prelievo in anestesia locale si marcano le lesioni che si desiderano prelevare con un cerchio di pennarello indelebile.

Anestesia
Si preferisce in genere l’anestesia locale, dato che il prelievo si esegue velocemente, è di piccole dimensioni e necessita solo uno o due punti di sutura. Nel sottocute sotto la lesione da prelevare (marcata preventivamente con un cerchio di pennarello indelebile) si iniettano da 0,5 a 1 ml di lidocaina 2% (lidocaina all’1% per i gatti, massimo 2 ml/gatto) o anestetico locale analogo, distribuendolo in diverse direzioni. Prima di eseguire il prelievo è consigliabile aspettare qualche minuto, in cui si possono preparare gli strumenti necessari per il prelievo.
E’ però indispensabile l’anestesia generale nei seguenti casi:
– gatti, a meno che non siano molto tranquilli e che il prelievo venga eseguito dal tronco. Nei gatti è possibile iniettare un massimo di 2 ml di lidocaina diluita all’1% con soluzione fisiologica per gatto, il che limita alla possibilità di prendere 1-4 campioni solamente.
– prelievi da zampe al di sotto dell’articolazione del gomito e del ginocchio
– prelievi da cuscinetti plantari e letti ungueali
– prelievi dalla testa in genere (tartufo, labbra, palpebre, padiglioni)
– prelievi dai genitali, scroto, ano
– animali irrequieti o aggressivi
– lesioni nel sottocute, ove sia impossibile eseguire un’anestesia locale

Selezione delle lesioni
La scelta delle lesioni da prelevare è determinante per l’ottenimento di una diagnosi precisa. Vanno prelevati preferibilmente più campioni (almeno 3) da lesioni primarie o di recente apparizione, quali macule, papule, pustole, vescicole, bolle, noduli e tumori. Non vanno prelevati campioni da aree che presentano lesioni secondarie, quali segni di autotraumatismo, trattamenti locali (creme), infezione e necrosi. In caso di lesioni multiple (o a differenti stadi di sviluppo) è bene prelevare più biopsie rappresentative di tutti i tipi di lesioni visibili sull’animale. E’ inoltre consigliabile inviare anche un campione prelevato da una zona apparentemente normale adiacente la zona lesionata.
Nelle lesioni nodulari e profonde, la biopsia va prelevata in profondità (meglio tramite escissione), al fine di ottenere un campione rappresentativo del sottocute.

Prelievo con punch
Quando possibile si consiglia di utilizzare punch di grandi dimensioni (6 o 8 mm), per facilitare il lavoro del tecnico di laboratorio e per avere maggiori probabilità che la biopsia sia diagnostica. Si possono utilizzare punch da 8 mm sul tronco e sulle cosce, mentre i punch da 6 mm vanno riservati per i cuscinetti plantari e per il tartufo dei cani di media e grossa taglia. Il punch da 4 mm va riservato per lesioni localizzate in aree particolari, quali il tartufo e i cuscinetti plantari di gatti e cani di piccola taglia e i padiglioni auricolari (specialmente la faccia interna, dove il derma non è mobile sulla cartilagine).
Si consiglia, se possibile, di prelevare più campioni (minimo 3), soprattutto se le lesioni hanno aspetti differenti, ad esempio una papula, una pustola, un collarette e una macula. E’ inoltre preferibile riporre campioni di lesioni differenti in contenitori diversi e numerati e descrivere separatamente l’aspetto delle lesioni e la loro localizzazione(facendo riferimento al numero del contenitore) sul modulo dell’anamnesi.
Il punch va posizionato perpendicolarmente alla superficie cutanea, che va tesa tra pollice ed indice sotto allo strumento. La lesione da prelevare va posta esattamente al centro del punch, poiché in laboratorio la biopsia viene sempre tagliata a metà, lungo il diametro del tassello cutaneo. Si esercita sul punch una pressione continua ruotando la strumento in un senso solo, sino a che non abbia perforato completamente il derma e abbia raggiunto il sottocute. A questo punto si ritrae il punch e si solleva il tassello afferrando il sottocute e il derma profondo con la pinzetta e lo si asporta tagliando il peduncolo di tessuto adiposo. E’ importante non afferrare l’epidermide e il derma superficiale con la pinzetta per evitare artefatti che potrebbero inficiare la lettura della sezione.
Le biopsie prelevate in zone cutanee dove il sottocute sia assente o sottile (padiglione auricolare) vanno delicatamente scollate dai tessuti sottostanti cercando di preservare il più possibile la struttura dell’epidermide.
Alcune zone cutanee richiedono una maggiore attenzione a causa del rischio di ledere i tessuti sottostanti. Queste sono le falangi (presenza dei tendini estensori e flessori), le labbra (presenza di arterie che corrono lungo tutto il perimetro della bocca), il padiglione (presenza della cartilagine sottostante), il tartufo (presenza della cartilagine sottostante), e ove si osservi la presenza di vasi evidenti (vene mammarie sull’addome, cefalica sul braccio, etc) che vanno evitate. In queste aree si consiglia di procedere con attenzione e eseguire lentamente prelievi meno profondi, sollevando ove possibile una plica cutanea fra due dita per allontanare il derma dalle strutture sottostanti.
Le biopsie così ottenute vanno delicatamente asciugate su un garza per eliminare l’eccesso di sangue, che disturba la lettura istologica, e immediatamente poste in formalina tamponata al 10%.
Il foro della biopsia si sutura con uno o due punti a seconda delle dimensioni e della localizzazione. Fanno eccezione le biopsie del padiglione auricolare (specialmente quelle della faccia interna), ove, a causa della ridotta mobilità del derma sulla cartilagine sottostante, è impossibile avvicinare i lembi della ferita senza distorcere il padiglione. In questi casi è sufficiente applicare un tampone di garza sulla ferita e fasciare strettamete l’orecchio sino ad ottenere un’emostasi spontanea. Il foro bioptico viene lasciato cicatrizzare per seconda intenzione (in genere si eseguono fori da 4 mm).

Prelievo per escissione
Il prelievo per escissione con bisturi è indicato per i seguenti casi:
– lesioni pustolose o vescicolose molto fragili o molto estese (più grandi del diametro del punch), che si romperebbero durante il prelievo con punch.
– lesioni piatte molto estese, quali erosioni o ulcerazioni. Poiché spesso per la diagnosi è importante valutare i margini della lesione, prelievi con il punch, di forma tonda, risulterebbero difficile da posizionare in modo da includere con certezza i margini della lesione nella sezione. Dalle biopsie escissionali prelevate con il lato lungo perpendicolare al margine della lesione, poichè per convenzione vengono tagliate lungo l’asse longitudinale, si ottengono per forza sezioni contenenti le aree di transizione interessanti per la diagnosi.
– lesioni nodulari che possono così venire escisse facilmente in toto.
Il prelievo per escissione a losanga si esegue con un bisturi in modo da includere la lesione o il margine di una lesione estesa al centro della biopsia.

Fissazione
Sia per le biopsie prelevate per escissione che per quelle con il punch è importante asciugare il sangue sulla superficie tramite carta assorbente e fare aderire il sottocute della biopsia su un pezzettino di legno (cucchiaio abbassa lingua) o su un cartoncino, e inserire tutto in formalina. Questa operazione eviterà che la biopsia si arricci e facilita molto il lavoro del patologo tagliatore. Le lesioni più piccole devono essere prelevate in toto (con punch o per escissione), di quelle più grandi è bene prelevare un campione dei margini, a cavallo fra il tessuto sano e quello malato (per escissione).
Poiché con la fissazione in formalina i colori scompaiono e la consistenza diventa omogeneo e solida, lesioni che a fresco appaiono molto evidenti (eritema, noduli palpabili, etc) possono non esserlo quando il tessuto è fissato. In questo caso allora si consiglia di marcare la lesione specifica con dei punti di sutura e allegare una dettagliata descrizione macroscopica. Per lo stesso motivo è importante eseguire il prelievo in modo che la lesione si trovi perfettamente nel centro, poiché per convenzioni tutte le biopsie vengono infatti tagliate perfettamente a metà
Campione e base vanno poi entrambi messi immediatamente in formalina, facendo attenzione che il campione si immerga bene e non galleggi sulla superficie. Per le lesioni nodulari di dimensioni superiori a 2 cm di diametro è importante eseguire dei tagli a tutto spessore a 1-2 cm di distanza l’uno dall’altro, lasciando le fette unite alla base, come per un filone di pane, in modo da orientare il patologo sulla forma e sulla dimensione del pezzo. Per i pezzi istologici di dimensioni superiori alla normale biopsia cutanea è importante rispettare il rapporto in volume di 1:10 fra il tessuto da fissare e la formalina. Si consiglia inoltre di inviare i pezzi in contenitori con l’apertura più larga del pezzo stesso, poiché la formalina indurisce i tessuti, rendendone poi impossibile l’estrazione da contenitori dalla bocca più stretta del loro diametro.
La formalina rimuove l’acqua legata ai tessuti e ne causa l’indurimento. In questo modo i tessuti diventano resistenti all’azione degli enzimi idrolitici. La formalina non è perfettamente stabile, e a contatto con l’ossigeno si trasforma in acido formico. Quest’ultimo non fissa bene i tessuti e ne causa artefatti che disturbano l’esame istologico. Per questo motivo si consiglia di usare formalina tamponata a pH 7 e di gettare quella più vecchia di un anno. A causa della forte tossicità della formalina si consiglia di non toccarla mai con le mani nude e di gettarla con i rifiuti speciali.Appena privati del loro apporto ematico, i tessuti iniziano un processo di autolisi, che causa la distruzione delle cellule. Anche la proliferazione di batteri saprofiti causa la degenerazione dei tessuti. E’ importante quindi porre ogni campione in formalina immediatamente dopo il prelievo e non aspettare di avere prelevato tutti i campioni prima di fissarli. Una piccola biopsia cutanea può essiccarisi sino a mostrare artefatti visibili microscopicamente, se lasciata anche solo 5 minuti sotto il calore id una lampada scialitica. Il periodo minimo di fissaggio in formalina è di 24 ore.

Invio al laboratorio
Prima di essere inviati al laboratorio i campioni non vanno tenuti in frigorifero, poiché se congelassero accidentalmente si otterrebbero degli artefatti nelle sezioni. Per questa ragione, se inviati con corriere in inverno in zone a clima particolarmente rigido (se si rischia che la temperatura scenda al di sotto dello zero) è consigliabile aggiungere un 10% di alcool alla formalina, per evitarne il congelamento.
I campioni vanno sempre accompagnati da una scheda anamnestica completa. E’ molto importante ricordare che più sono dettagliate le informazioni che si danno al patologo, più probabile è che si riceva una diagnosi precisa o delle indicazioni utili. E’ preferibile porre campioni di lesioni differenti o provenienti da siti differenti in contenitori differenti e numerati, e specificare sul modulo di richiesta la provenienza o il tipo di lesione per ogni campione.
Una compilazione accurata del modulo di richiesta in ogni sua parte aiuta molto il dermatopatologo nella formulazione della diagnsi più esatta. In particolare è importante fornire dati sulla specie, razza, età e sesso dell’animale, sulla distribuzione delle lesioni e sul sito di prelievo delle biopsie. La descrizione macroscopica delle lesioni è fondamentale, come anche informazioni sulla durata della malattia e sulla presenza eventuale di manifestazioni sistemiche, compreso il prurito.
Infine è anche importante fornire informazioni sulle terapie già somministrate, sul tipo di farmaco, la durata del trattamento, il suo effetto e la data dell’ultima somministrazione. Una lista delle possibili diagnosi differenziali può completare i dati anamnestici.

Cosa succede in laboratorio?
La biopsia viene tolta dalla formalina e viene sezionata in due metà, lungo il senso longitudinale di crescita dei peli. Per questo motivo è importante lasciare un po’ di peli per guidare il tagliatore. Poi i campioni vengono processati con alcol e xilolo e posti in un blocco di formalina. I blocco viene poi passato al microtomo che ne taglia fette spesse da 4 a 6 um. Queste sezioni vengono poi raccolte su un vetrino portaoggetti e colorate secondo le necessità. I campioni colorati vengono poi montati con un vetrino coprioggetti e una goccia di colla. Così sono pronti per essere letti dal dermatopatologo. E’ importante scegliere un laboratorio veterinario con un patologo con interesse speciale per la dermatopatologia. E’ assolutamente sconsigliato rivolgersi ad un patologo o dermatopatologo di medicina umana. Infine può essere utile ricordare che i tempi tecnici di lavorazione di un pezzo sono di minimo due giorni, esclusa la lettura del patologo, ma possono anche allungarsi a una o più settimane se sono necessari la decalcificaizione, le colorazioni speciali o l’immunoistochimica.

Cosa aspettarsi da un referto bioptico?
A volte, nonostante sia stato effettuato un prelievo a regola d’arte, il referto bioptico non offre una diagnosi definitiva, ma dà solo alcuni suggerimenti generali. Questo accade poiché alcuni aspetti istopatologici sono comuni a più dermatosi (ad es. le endocrinopatie o le allergie) e poiché i veterinari clinici prelevano biopsie soprattutto da casi inusuali, da patologie di cui si conosce ancora poco della patogenesi o dell’eziologia. Una risposta negativa (“non é …“) ha anch’essa il suo valore e va presa attentamente in esame. Infine bisogna sempre ricordare che la biopsia rivela la situazione della cute al momento del prelievo, e che ogni patologia cutanea al contrario ha uno sviluppo che può variare nel tempo. Formulare una diagnosi con un’immagine statica di un processo dinamico può essere a volte molto difficile. Sarà compito del clinico valutare il referto istopatologico alla luce delle manifestazioni cliniche dell’animale e scegliere la terapia più appropriata.

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