Per la diagnosi di Leishmania oltre ai convenzionali esami microscopici, culturali e sierologici, sono stati sviluppati numerosi test basati sul DNA mediante l’utilizzo della tecnologia PCR. La sensibilità di questi metodi è variabile, in base alla scelta della sequenza genica bersaglio ed alla matrice biologica utilizzata.
Nel nostro laboratorio abbiamo messo a punto due differenti protocolli, ottimizzati per avere in entrambi i casi un’elevata sensibilità, ed utilizzabili alternativamente a seconda degli obbiettivi diagnostici.
1. Leishmania HS (alta sensibilità): consiste in una Nested-PCR che grazie a una duplice reazione di amplificazione del DNA consente una sensibilità molto elevata e rappresenta ad oggi la tecnica di elezione per il riscontro del parassita nei vari materiali qui sottoelencati; l’utilità di tale metodica si evidenzia nei casi in cui la sintomatologia è riferibile a Leishmaniosi ma test immunologici o di PCR tradizionale sono risultati negativi. E’ una tecnica puramente qualitativa e non permette di quantificare il carico parassitario.
2. Leishmania spp: basata sulla tecnologia PCR-Real Time, permette la quantificazione della sequenza genica target (DNA del chinetoplasto degli amastigoti). La tecnica consiste nell’amplificazione del DNA del campione in esame, quantificato mediante confronto con DNA parassitario diluito a concentrazioni note permettendo così di rilevare il carico parassitario; la sensibilità è pari a 0.0125 parassiti/ml di sangue. L’utilizzo di questa metodica è indicato sia per effettuare la diagnosi, sia (soprattutto) per monitorare l’efficacia terapeutica.
Di seguito i materiali idonei per la ricerca di Leishmania mediante PCR:
Linfonodi
o Alta sensibilità e specificità
o Facile esecuzione
Midollo Osseo
o Alta sensibilità e specificità
o Prelievo più complesso
Sangue (Buffy Coat)
o Specifico, ma poco sensibile. Eseguire un esame PCR su sangue – con una bassa sensibilità in termini di successo diagnostico, molto inferiore alle altre matrici – è quindi sconsigliato.
Milza
o Sensibilità di circa l’86% in sintomatici
Congiuntiva (membrana millipore)
o Sensibilità di circa il 90%, specificità del 100%, positivo a 45 gg. p.i.
Cute
o Lesioni
Vogliamo sottolineare quindi che il prelievo tramite membrana millipore oculocongiuntivale – che noi eseguiamo da anni come metodica di indagine per le malattie dell’occhio – si è rivelato estremamente valido nella diagnosi precoce di leishmaniosi.
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