Utilizzo di differenti siti di campionamento per la diagnosi di Parvovirosi canina attraverso PCR

Il parvovirus canino (CPV-2) è trasmesso in modo diretto per via fecale-orale da cane a cane, e per via oro-nasale in ambiente contaminato. La replicazione virale ha luogo primariamente nell’orofaringe e nel tessuto linfoide locale, a cui fa seguito la viremia a partire da 1-5 giorni post-infezione. Il virus si localizza quindi nei tessuti contenenti cellule in attiva replicazione, come ad esempio la mucosa gastrointestinale, il midollo osseo e il tessuto linfoide.

Una diagnosi di certezza precoce è essenziale per porre in isolamento esclusivamente i cani realmente positivi. La PCR è considerata tra i metodi diagnostici più sensibili, e viene eseguita di routine sulle feci (considerate il mezzo di maggiore escrezione virale). Tuttavia, questa metodica richiede tempo e la sensibilità diagnostica può essere diminuita dalla presenza di inibitori.

Utilizzando una PCR quantitativa per la ricerca di CPV-2, Segev et al. ne hanno valutato la sensibilità e specificità relativamente alla diagnosi clinica di parvovirosi. Sono state inoltre valutate sensibilità e specificità di 3 siti di campionamento differenti: sangue in EDTA, tampone faringeo, tampone rettale. Gli autori hanno inoltre ricercato il virus sugli stessi campioni utilizzando sia la metodica PCR quantitativa sia un test PCR point of care (PoC), per valutare l’agreement tra le due metodiche. Sono inoltre stati testati su tutti i cani inclusi nello studio gli anticorpi IgM anti CPV-2, per identificarne un possibile utilizzo diagnostico.

129 cani sono stati inclusi nello studio, e sono stati divisi nei seguenti gruppi:

• Gruppo 1: 60 cani con diagnosi clinica di parvovirosi. Tali cani sono stati valutati retrospettivamente; sono stati inclusi in questo gruppo cani con segni clinici quali anoressia, vomito e diarrea, e leucopenia (<5.000 WBC/uL).
• Gruppo 2: 44 cuccioli sani non vaccinati. Questi cani sono stati valutati in modo prospettico effettuando la PCR su tutti i siti di campionamento prima della vaccinazione e, per alcuni di loro, 10 e 20 giorni dopo la prima vaccinazione e 12 e 28 giorni dopo la seconda vaccinazione.
• Gruppo 3: 15 cani sani adulti di proprietà. Anche in questo caso vi è stata una valutazione prospettica; alcuni dei cani sono stati inoltre testati anche dopo la vaccinazione annuale per parvovirus.
• Gruppo 4: 9 cuccioli con sintomi gastroenterici con diagnosi di cimurro.

Entrambe le metodiche PCR si dimostrano altamente sensibili rispetto alla diagnosi clinica, e hanno dimostrato tra loro un agreement del 98%. Tutti i cani con diagnosi clinica di parvovirosi sono risultati positivi in almeno uno dei siti di campionamento, e l’83% da tutti e 3. Il tampone faringeo ha dimostrato la sensibilità più alta (98% di positivi nel primo gruppo), mentre la maggior parte dei risultati falsi negativi è stata riscontrata con l’uso dei tamponi rettali (88% di positivi). Sequenziando il virus, in tutti i cani positivi sono stati riscontrati esclusivamente ceppi virali di campo. Gli autori non sono stati in grado di determinare una carica virale minima indicativa di malattia.

Nei cuccioli, fino a 3 settimane dopo la vaccinazione è stato comune trovare la PCR positiva nei campioni fecali (62% di positivi a 10 e 20 giorni post-vaccino), mentre l’utilizzo del tampone faringeo ha mostrato la minore percentuale di positività post-vaccinale (12% a 10 giorni post-vaccino, 0% a 20 giorni post-vaccino). Il tasso di positività è inoltre calato drasticamente dopo l’iniezione del booster. In generale, gli autori hanno riscontrato che a partire dalla 3° settimana dopo la prima dose vaccinale l’utilizzo del tampone faringeo come substrato per la PCR ha dimostrato ottima specificità, in quanto nessuno dei cuccioli è più risultato positivo. La differenza del tasso di positività tra il tampone faringeo e il tampone rettale è stata attribuita dagli autori alla via di vaccinazione, che permette una replicazione virale importante nell’intestino ma non nel faringe. Nessuno dei cuccioli vaccinati ha sviluppato sintomi compatibili con la malattia durante lo studio, e il sequenziamento genico ha dimostrato la presenza esclusiva del ceppo vaccinale. Tutte le positività riscontrate alla PCR sono quindi state attribuite alla recente vaccinazione.

Il gruppo contenente cani adulti sani ha mostrato completa negatività alle PCR, sia prima che dopo la vaccinazione annuale. Anche i cuccioli con sintomi compatibili con parvovirosi ma diagnosi finale di cimurro sono risultati negativi alle PCR, in tutti i siti campionati.

La sierologia per IgM ha mostrato positività nel 92% dei casi di malattia, di cui il 55% con un titolo alto (1:6250). Il titolo delle IgM era negativo in tutti i cuccioli prima della vaccinazione, mentre tutti sono diventati positivi a medio-alto titolo dopo la vaccinazione. Nei cani adulti sani invece il titolo IgM è rimasto negativo sia prima che dopo la vaccinazione annuale (al contrario, il titolo IgG è rimasto persistentemente alto).

Di seguito i take home messages che consideriamo più importanti:

• L’uso del tampone rettale come matrice per la diagnosi di parvovirosi ha determinato il maggior numero di falsi negativi (cioè, è la matrice con minore sensibilità). Segue il sangue in EDTA, mentre il tampone faringeo ha dato in generale la minore percentuale di falsi negativi in cani con parvovirosi.
• Nei cuccioli vaccinati da poco il tampone rettale rischia di dare un numero elevato di falsi positivi (bassa specificità), seguito dal sangue in EDTA. La matrice che dà meno falsi positivi è sempre il tampone faringeo.
• Un risultato positivo alla PCR in cani con segni clinici compatibili è da considerarsi indicativo di malattia nei cani non vaccinati e nei cani che hanno completato il ciclo vaccinale. È invece da interpretare con cautela nei cani che hanno ricevuto la prima dose vaccinale da meno di tre settimane. L’escrezione del virus vaccinale è infatti alta e la PCR spesso risulta positiva, soprattutto se si utilizza una matrice fecale, e le PCR attualmente in commercio non sono in grado di distinguere tra il ceppo di campo e il ceppo vaccinale.
• La sierologia per IgM positiva suggerisce fortemente la presenza di malattia in cani non vaccinati o che hanno già completato il ciclo vaccinale. La negatività alle IgM non esclude la malattia poiché nelle fasi iniziali dell’infezione è comune avere un titolo negativo o basso. Nei cuccioli vaccinati da poco con la prima dose il titolo IgM sarà elevato e non può quindi essere utilizzato per la diagnosi.

Dr.ssa Manuela Zanetti, DVM – Dr.ssa Silvia Rossi, DVM, Dipl.ECVCP

Bibliografia

• Effect of sampling site on the diagnosis of canine parvovirus infection in dogs using polymerase chain reaction. Segev et al., J Vet Intern Med. 2022;36:591-598. DOI: 10.1111/jvim.16373