BiEsseA  s.r.l.
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13/7/2005

CONSIDERARE L’IMMUNOISTOCHIMICA A PRIORI QUANDO SI DECIDE DI INVIARE  AL LABORATORIO LA  RICHIESTA DI ESAME ISTOLOGICO

Nov 2004

Free light-chain proteinuria and normal renal histopathology and function in 11 dogs exposed
to Lleishmania infantum, Ehrlichia canis, and Bbabesia canis.

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 La chiave per diagnosticare i tumori è la comparazione fra le cellule normali e la loro controparte neoplastica, perciò l’identificazione cellulare è facile ed agevole quando i tumori sono ben differenziati. In presenza di neoplasie scarsamente differenziate identificare l’origine tessutale risulta difficile e problematico. Tuttavia un’accurata diagnosi è decisiva per il protocollo terapeutico e per la prognosi del paziente.

Recentemente anche i laboratori veterinari hanno a disposizione un discreto numero di anticorpi per i test Immunoistochimici. Alcuni di questi reagiscono solo con un tipo di cellule cancerose (monoclonali) mentre altri (policlonali) hanno la possibilità di “incrociarsi” con differenti linee cellulari. E’ così possibile determinare l’origine esatta delle cellule con una minima possibilità d’errore.

Negli ultimi due anni presso la BiEsseA quindi abbiamo standardizzato le metodiche per l’identificazione e la tipizzazione di numerose patologie neoplastiche.

E' necessario puntualizzare alcuni concetti fondamentali per la buona riuscita dell’esame.  La maggior parte delle procedure immunoistochimiche usate prevede tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina; lo scopo principale di questa procedura è di “fissare” le proteine antigeniche del tessuto in modo da renderle adeguatamente disponibili, e quindi accessibili,  all’anticorpo primario.La fissazione è dunque la procedura più critica ma altresì più importante per la buona riuscita dell’immunoistochimica, che localizzerà soltanto gli antigeni resi riconoscibili all’anticorpo. Molti campioni che giungono al nostro laboratorio non sono purtroppo in condizioni ottimali di fissazione: infatti, o sono troppo grandi e di spessore elevato (la formalina penetra per 0.5 cm l’ora) oppure sono di dimensioni adeguate ma in un volume di fissativo troppo ridotto rispetto alla massa del campione inviato.

Una fissazione inadeguata può distruggere definitivamente gli antigeni o disperderli dal sito di sintesi  al  tessuto circostante, determinando quindi numerosi artefatti che rendono illeggibile il vetrino. Un tessuto ipofissato inoltre può preservare gli antigeni ma alterare la morfologia stessa del tessuto, rendendo difficile l’interpretazione della lesione; al contrario, tessuti troppo fissati saranno dal punto di vista morfologico migliori, ma una quantità maggiore di determinati antigenici potrà essere distrutta o nascosta. La fissazione ottimale sarà dunque quella che ottiene la miglior morfologia nel tempo minimo a preservare l’antigene.

Il fissativo migliore in questo senso è sicuramente la formalina; per l’uso in microscopia la formalina deve essere FRESCA ad una concentrazione compresa fra il 4% e il 10% tamponata a pH 7-7,6.(Formalina di Policard al 10% con una concentrazione di Cloruro di Sodio allo 0.9%).

Il tempo di fissazione è critico e dovrebbe essere compreso fra le 2 e le 24 ore, secondo lo spessore del campione. I risultati migliori si ottengono con campioni di tessuto di piccole dimensioni immersi in adeguato volume di fissativo il più rapidamente possibile. Per frammenti di 2 cm di superficie e di 4 mm di spessore, si consiglia un volume minimo di 200 ml di fissativo.

In seguito i campioni saranno disidratati e processati secondo le usuali tecniche di laboratorio.
Alcune ulteriori informazioni:

• I tumori di origine epiteliale  si colorano positivamente con vari filamenti di Citocheratina (CK pool);

• I filamenti Neuronali sono diagnostici per le cellule neurali e per alcuni tumori neuroendocrini.

• La Vimentina, un filamento intermedio, è presente nella maggior parte dei tumori di origine mesenchimale, come i sarcomi o altre neoplasie non epiteliali;

• La Desmina  è presente nelle cellule muscolari e quindi nei tumori derivati, così come l’Actina.

• Le catene Kappa e Lambda sono un eccellente marcatore per le plasmacellule.

• S100 e Enolasi non specifica sono proteine spesso utili per evidenziare tumori melanocitari non melanotici.

• CD3 e CD79 cyalfa, sono markers specifici rispettivamente per i linfociti T e B.

 E’ tuttavia fondamentale la consultazione diretta con il patologo (o con l’oncologo) per un’accurata ed appropriata selezione delle colorazioni.

Valutando così i risultati delle tipizzazioni immunoistochimiche nel contesto dell’aspetto del tumore dopo l’esame istologico di routine, sarà possibile classificare il tumore in un modo corretto ed effettuare terapie mirate.

 Daniela Olivero – DMV
Emanuele Minetti - DMV

Bibliografia:
Veterinary medicine Kevin Hahyn Gulf Coast Veterinari specialists 1111 West Loop South, Houston TX Aprile 2005
Caleidoscopio Italiano -Tecniche di Immunoistochimica - 1999

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Cari Colleghi,
mi permetto di allegarVi l'estratto dell'articolo pubblicato su Journal Vet. Internal Medicine di settembre-ottobre 2004 augurandomi sia di Vostro interesse.
Un enorme ringraziamento ai colleghi Ugo Bonfanti, Andrea Zatelli, Eric Zini con i quali abbiamo avuto l'onore ed il piacere di condividere questa non facile impresa.
Altri articoli sull'argomento SDS-Age e Proteinuria sono disponibili sul nostro sito internet a compendio e completamento di quest'ultimo. 
Vi ricordo che a tutti i lavori ha partecipato il nostro laboratorio nell'esecuzione dei test sulle urine.
 

 "1: J Vet Intern Med. 2004 Sep-Oct;18(5):618-24.

Free light-chain proteinuria and normal renal histopathology and function in 11 dogs exposed to Lleishmania infantum, Ehrlichia canis, and Bbabesia canis.

Bonfanti U, Zini E, Minetti E, Zatelli A.

The purpose of this retrospective study was to investigate the relationship among proteinuria consisting of immunoglobulin free light chains (FLCs), renal histopathologic findings, and routine markers of renal function in 11 dogs exposed to Leishmania infantum (n = 8), Ehrlichia canis (n = 2), and Babesia canis (n = 1). FLC proteinuria was suspected based on identification of a 22- to 27-kDa band by sodium dodecyl sulfate-agarose gel electrophoresis (SDS-AGE) and later confirmed by immunofixation electrophoresis. SDS-AGE identified an isolated band of 22-27 kDa in 8 dogs, whereas the remaining 3 had a 22- to 27-kDa band and an additional band of 67-72 kDa. The median urine protein-to-urine creatinine ratio was 0.37 (range, 0.11-2.24) and increased ratios were found in 6 dogs (54.5%) (reference value, <0.7). All dogs underwent histologic examination of renal percutaneous biopsy specimens and determination of serum creatinine and urea concentrations. Tissue samples for light microscopy were stained with hematoxylin-eosin, periodic acid-Schiff, Goldners trichrome, and methenamine silver. In the study group, the glomerular tufts, mesangium, tubulointerstitium, and vessels appeared unaffected. The median serum creatinine concentration in these 11 dogs was 1.3 mg/dL (range, 0.8-1.5 mg/dL; reference range, 0.6-1.5 mg/dL), whereas the concentration for urea was 28 mg/dL (range, 22-52 mg/dL; reference range, 20-50 mg/dL). All dogs had normal renal morphology and had normal serum creatinine and urea concentrations, suggesting that immunoglobulin FLC may be detected in the urine of dogs exposed to L. infantum, E. canis, and B. canis without any apparent structural or functional renal derangement.

PMID: 15515575 [PubMed - in process]"
 

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